Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Chirurgie
- Pour les enregistrements électrophysiologiques, utilisez de l’uréthane (ATTENTION) pour l’anesthésie.
prudence: L'uréthane est toxique et cancérigène, respectez donc toujours les règles de sécurité et la fiche technique fournies par le fabricant de la substance.
- Préparez une solution d’uréthane à 200 mg/mL dans une solution saline médicale de chlorure de sodium (NaCl) à 0,9 %.
- Administrer un total de 1,3 g/kg de poids corporel d’uréthane par voie intrapéritonéale (IP). Selon la souche de rat, il peut être raisonnable de diviser la dose en deux doses avec un intervalle de 15 minutes entre les injections afin d’améliorer la sécurité de l’anesthésie.
- Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en utilisant le réflexe de retrait de la pédale et d’autres réflexes appropriés. Si l’anesthésie n’est pas assez profonde pour effectuer une intervention chirurgicale, injectez 0,15 g/kg de poids corporel d’uréthane IP et attendez encore 15 min.
- Appliquez une pommade oculaire pour prévenir la déshydratation de la cornée.
- Surveillez constamment la fréquence respiratoire et le réflexe de retrait de la pédale pendant l’anesthésie. Utilisez un coussin chauffant pour petits animaux avec contrôle de la température pour vous assurer qu’une température corporelle physiologique est maintenue tout au long de la chirurgie. Avant de commencer les enregistrements électrophysiologiques, passez à une alternative non électrique (par exemple, un coussin de tête en acétate de sodium).
- Rasez la fourrure le long de la face dorsale de la tête pour obtenir un champ chirurgical propre. Désinfectez autour du site d’incision avec un désinfectant chirurgical approprié. Fixez l’animal dans le cadre stéréotaxique.
- Effectuez une incision de 2 cm de long du cuir chevelu dans le sens sagittal avec un scalpel. À l’aide d’un scalpel, grattez légèrement l’aponévrose du crâne et désinfectez le crâne. Utilisez des cotons-tiges imbibés de peroxyde d’hydrogène à 3 % (H2O2) pour enlever tout tissu restant.
- Utilisez un électrocausoir ou un thermocausoir pour contrôler les saignements, si nécessaire. Arrêtez les saignements de l’os du crâne et de l’hypoderme, si le saignement ne s’arrête pas spontanément après 1 à 2 minutes et gêne la vue sur le crâne.
- Ajustez la barre incisive jusqu’à ce que la tête soit positionnée en position crâne plate, ce qui signifie que le bregma et le lambda en tant que points de référence stéréotaxiques sont dans le même plan. Ceci est le plus important pour obtenir une précision chirurgicale élevée. À l’aide d’un outil d’alignement stéréotaxique standard, calibrez l’extrémité désignée sur le bregma sous vision microscopique et ajustez la barre incisive jusqu’à ce que les points désignés pour le bregma et le lambda sur l’outil touchent le crâne en même temps.
note: Une vue d’un côté avec une lumière focalisée de l’autre peut aider à déterminer cette condition. Alternativement, prenez un support stéréotaxique avec une canule fine et mesurez les coordonnées dorso-ventrales de Bregma et lambda sous vision microscopique. Ajustez la barre incisive jusqu’à ce que les coordonnées dorso-ventrales de Bregma et lambda soient les mêmes.
- Utilisez un support stéréotaxique avec une canule, calibrez le bregma, puis calculez la position de tous les trous de perçage sur le crâne. À l’aide du support stéréotaxique, marquez les positions des trous à percer soit en grattant soigneusement le crâne, soit à l’aide d’un marqueur de couleur chirurgical. Les coordonnées dépendent des cibles ; Les coordonnées par rapport au Bregma sont données pour la voie hyperdirecte dans le tableau 1, y compris les coordonnées suggérées pour les électrodes de référence cérébelleuses.
- À l’aide d’une micro-perceuse, percez soigneusement tous les trous. Pour le noyau sous-thalamique (STN) et la substantia nigra pars reticulate (SNr), percez un trou commun (d’environ 2 mm x 3 mm). Tous les autres trous de perçage doivent avoir un diamètre d’environ 1 mm.
- Prenez deux canules fines (au moins 27 G) et pliez leurs extrémités pour former une forme crochue, à l’aide d’une surface dure ou d’une pince à épiler. Utilisez-les pour enlever tous les débris des trous de forage, et coupez et retirez soigneusement la dure-mère dans le trou STN/SNr commun.
- Rincez les trous de forage avec une solution saline physiologique. Appliquez une goutte de solution saline physiologique toutes les 15 minutes sur les trous de forage pour éviter le dessèchement du cerveau et de la dure-mère.
- Prenez un micro-foret et une micro-vis en acier inoxydable assortie (par exemple une vis M de 1,2 mm x 2 mm), percez un trou et vissez une micro-vis entre les trous de forage des électrodes péridurales de référence au-dessus du cervelet, faites de même pour les électrodes péridurales M1.
- Glissez les électrodes péridurales Ag/AgCl que vous avez fabriquées vous-même dans les trous de perçage des électrodes de référence et des électrodes M1. Guidez la pointe de l’électrode à l’aide d’une pince à épiler fine et faites-la glisser directement sous l’os du crâne dans le trou de perçage.
- Fixez toutes les électrodes péridurales avec de l’acrylique dentaire à deux composants. Assurez-vous de ne pas couvrir le point de bregma ni d’affecter le trou STN/SNr commun.
- Insérez le support préparé avec les électrodes en microfil de tungstène dans le cadre stéréotaxique.
- Calibrez l’électrode la plus ventrale, qui est destinée à cibler le STN, sur le bregma. Ajustez à la position calculée au-dessus du trou STN/SNr commun et abaissez les électrodes jusqu’au cerveau sous vision microscopique. Assurez-vous que les électrodes des microfils de tungstène pénètrent doucement dans le cerveau.
2. Cartographie et enregistrements électrophysiologiques
REMARQUE : Pour cette étape, une cage de Faraday et un système d’enregistrement électrophysiologique multicanal avec un logiciel d’enregistrement capable de filtrer et de trier les pointes en ligne sont nécessaires. Utilisez de préférence un système qui fonctionne avec un préamplificateur positionné près de la tête des animaux pour réduire au minimum le bruit électrique et les artefacts. Outre les électrodes à microfils de tungstène, au moins une péridurale et une électrode de référence sont nécessaires pour effectuer des enregistrements de la voie hyperdirecte. Il est recommandé d’insérer les électrodes péridurales et de référence par paires sans qu’elles ne se touchent, ce qui aide en cas de dysfonctionnement et permet différents types de référencement dans l’analyse des données.
- Placez une cage de Faraday mobile au-dessus du cadre stéréotaxique. Si seule une cage de Faraday stationnaire est disponible, déplacez soigneusement le cadre stéréotaxique dans la cage de Faraday tout en vous assurant que les électrodes cérébrales profondes ne sont pas abaissées dans le cerveau jusqu’à ce que le cadre stéréotaxique soit dans sa position finale.
- Connectez les électrodes à la tête de l’installation électrophysiologique. Assurez-vous que les électrodes de référence sont connectées aux canaux de référence appropriés.
- Configurez le logiciel d’enregistrement : filtre passe-bande (0,05-8 000 Hz) et amplifiez (gain 1 500-2 000x) le signal de données brutes. Utilisez un filtre LFP et spike en ligne avec les paramètres appropriés (filtre passe-bande 0,05-250 Hz pour les LFP, filtre passe-bande 300-8 000 Hz pour MUA). Pour tous les filtres, utilisez un filtre de type Butterworth.
- Définissez un seuil de pointe, le cas échéant, pour le tri des pointes en ligne. La plupart des logiciels d’enregistrement permettent de configurer un seuil de pointe, qui est une valeur d’amplitude au-dessus de laquelle un signal est marqué comme un pic par le logiciel. Ce seuil peut être déterminé mathématiquement soit comme un facteur ou un écart-type de l’amplitude moyenne du signal de pointe filtré, soit de préférence par inspection visuelle de segments de données <500 ms et configuré comme une ligne au-dessus du bruit du signal dans une interface utilisateur graphique.
note: L’intention de la mise en place d’un seuil de pointes est de compter les pointes et de trier les unités afin de fournir des informations sur le nombre de neurones actuellement enregistrés et la forme de leurs pointes.
- Abaissez lentement les électrodes des microfils de tungstène à 1 mm de la dorsale de la cible, qui est STN pour voie hyperdirecte. Attendez que le signal se stabilise si nécessaire.
- Pour la cartographie électrophysiologique, avancez les électrodes ventralement par pas de 100 μm. À chaque étape, évaluez le modèle de tir, la cadence de tir et la forme des pointes. Comparez-les avec les exemples typiques donnés dans la figure 1. Généralement, les noyaux denses présentent des pointes rapides et continues sur plusieurs étapes dorso-ventrales, tandis que les structures riches en fibres présentent de faibles taux de décharge et une activité de pointe moins homogène dans les étapes ventrales suivantes.
- Pour la voie hyperdirecte, assurez-vous que l’électrode la plus ventrale se trouve à l’intérieur de STN.
note: Le STN est atteint lorsqu’une augmentation considérable de la MUA est détectée ventrale de la Zona incerta. Ventralement au STN, le dopage s’arrête presque complètement parce que l’électrode a atteint la capsule interne. Lorsque l’électrode la plus ventrale est en STN, la configuration des microélectrodes en tungstène garantit que la deuxième électrode postérieure est en SNr. Un réglage fin dorsorsale par petits incréments peut être nécessaire pour enregistrer le MUA typique en STN et SNr en même temps. Notez que la fréquence des MUA dépend du nombre de neurones réellement enregistrés et du niveau d’activation cérébrale.
- Une fois que les électrodes sont dans les structures souhaitées, mettez en place le filtrage en ligne et le tri par pointes (voir Figure 2), puis lancez l’enregistrement des données. La figure 3 montre des exemples typiques des différents états de synchronisation corticale qui peuvent être identifiés dans les enregistrements LFP.
Tableau 1 : Coordonnées stéréotaxiques pour l’enregistrement de la voie hyperdirecte des ganglions cortico-basaux. Tous les points sont mesurés à partir du point de référence du bregma sur le crâne en mm ; n.a.- Sans objet.
| Coordonnées de Bregma | Stn | Snr | M1 | Référence 1 | Référence 2 |
| antéro-postérieur | -3,6 | -4,8 | +3,0 | -10,0 | -10,0 |
| médio-latéral | +2,5 | +2,5 | +3,0 | +3,0 | -3,0 |
| dorsale-ventrale | -8,0 | n. a. | n. a. | n. a. | n. a. |
