Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation quotidienne de l’appareil expérimental
- Mettez l’amplificateur, l’ordinateur et la caméra sous tension, puis vérifiez que le logiciel est en cours d’exécution.
- Placez du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) dans un tube de 50 mL et faites une bulle avec du carbogène.
- Utilisez une pompe péristaltique pour faire circuler l’ACSF. Ajustez le débit à environ 1 mL/min.
- Ajustez la hauteur de la pipette d’aspiration de manière à ce que le niveau de liquide à l’intérieur de la chambre d’expérimentation soit toujours constant.
note: Le niveau de la solution est important pour obtenir un enregistrement stable, par conséquent, le réglage doit être effectué à l’aide d’un micromanipulateur.
- Installez l’électrode de terre composée d’une puce jaune remplie de gélose 3 M KCl (2 %) dans un support avec un fil Ag-AgCl avec une petite quantité de solution 3 M KCl.
- Versez une petite quantité d’ACSF (environ les deux tiers du volume) dans l’électrode en verre (1 mm de diamètre extérieur, 0,78 mm de diamètre intérieur tiré avec un extracteur de micropipette) à l’aide d’une pointe jaune mince et effilée et placez-la dans le porte-électrode.
- Fixez le support à la tige installée dans le manipulateur. Assurez-vous à l’aide d’un amplificateur que la résistance de l’électrode est d’environ 1 MΩ.
note: L’électrode de type patch à longue tige et à large ouverture (ouverture de 4 à 8 μm) devrait être bonne pour l’enregistrement sur le terrain et comme électrode stimulante.
2. Démarrage d’une session d’enregistrement
- Prélever une tranche de préparation dans la chambre humide à l’aide d’une pince.
- Placez rapidement la tranche dans une chambre d’expérimentation sous le microscope (Figure 1).
- Enfoncez fermement le bord de l’anneau dans le joint torique en silicone. Veillez à ne pas casser la membrane ou le fond de la chambre d’expérimentation.
note: La direction de la tranche doit être prise en considération par rapport à la direction des électrodes de stimulation et d’enregistrement dans le champ de vision. La tranche saine doit coller au filtre à membrane, il n’est donc pas nécessaire d’utiliser d’autres appareils pour fixer les tranches, tels que des poids et des mailles en nylon.
- Placez la pointe de l’électrode de stimulation et l’électrode d’enregistrement du potentiel de champ sur la coupe sous le microscope avec de la lumière transmise.
- Utilisez le système d’enregistrement électrophysiologique pour vérifier la réponse. Confirmez l’enregistrement électrophysiologique habituel (non coloré) avec la configuration donnée.
note: L’électrode d’enregistrement peut être omise, mais elle est utile pour vérifier la physiologie de la tranche.
- Réglez l’intensité de la lumière d’excitation à environ 70-80 % de la capacité maximale de la caméra, ce qui correspond à 13-15 mW/cm2 sur l’échantillon lors de l’échantillonnage à 10 kHz avec un objectif à immersion dans l’eau 5x et 1x lentille de tube PLAN APO. La longueur d’onde de la lumière d’excitation est de 530 nm et le filtre d’émission doit être > 590 nm.
note: Utilisez un obturateur pour minimiser la quantité de lumière d’excitation. Une exposition continue à la lumière peut détériorer la physiologie de la tranche. L’effet nocif possible de la lumière dépend de l’intensité et de la durée de la lumière. Utilisez l’enregistrement électrophysiologique pour juger de l’effet de la lumière. Dans le cas d’une intensité de 13-15 mW/cm2, une exposition d’environ 1 s doit être la limite supérieure de la tolérance.
- Ajustez la mise au point avec le système d’acquisition à l’aide de la source de lumière fluorescente car la mise au point peut être différente en fonction de la longueur d’onde et lancez l’acquisition.
- Examinez les données dans un logiciel d’acquisition d’images.
note: Nous avons utilisé le package de microprogrammation original d’un logiciel d’analyse numérique pour une analyse détaillée.
