Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Animaux
- Utilisez des souris génétiquement modifiées OR-IRES-tauGFP (OR = récepteur olfactif, IRES = site d’entrée interne des ribosomes, tauGFP = protéine fluorescente tau-vert) disponibles au Jackson Laboratory. Ces souris ont été développées dans le laboratoire du Dr Peter Mombaerts afin d'analyser le ciblage axonal et le développement du système olfactif. Par exemple, la lignée MOR23-IRES-tauGFP, numéro de commande 006643, porte le nom officiel de souche B6 ; 129P2-OLFR16tm2Maman/MamanJ ; de même, la ligne SR1-IRES-tauGFP, numéro de commande 6717, porte le nom officiel B6 ; 129P2-OLFR124tm1Maman/MamanJ.
- En ce qui concerne l’âge des animaux : pour un meilleur résultat du protocole, utilisez des animaux âgés de 2 à 4 semaines. Dans cette tranche d’âge, la dissection est plus facile (os plus mous, épithélium olfactif plus ferme) et les boutons dendritiques sont plus gros par rapport aux animaux plus âgés.
2. Préparation des électrodes et des solutions
- Pour les pipettes stimulantes : achetez des pipettes stimulantes pré-tirées. Sinon, préparez-les manuellement.
- À l’aide d’une flamme, pliez six pipettes en verre de 1 mm à environ 1 cm de la pointe. Insérez ces six pipettes ainsi qu’une gaine thermorétractable droite de 7e po de 1,5 cm renforcée par un œillet.
- La chaleur rétrécit le tube pour maintenir les barils attachés ensemble. Fixez une gaine thermorétractable supplémentaire à l’autre extrémité des canons. Tirez cette pipette stimulante à l’aide d’un extracteur multi-barils.
- Ajoutez un peu de colle liquide blanche autour de l’œillet pour renforcer les pointes pliées. Laisser sécher toute la nuit (non/nuit).
- Préparez 1 ou 2 L de solution extracellulaire normale de Ringer (en mM : NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1,25, glucose 15 ; pH 7,6 et 305 mOsm). Conserver à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
- Préparer une solution mère intracellulaire (en mM) : KCl 70, KOH 53, acide méthanesulfonique 30, acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA) 5, acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) 10, saccharose 70 ; pH 7,2 (KOH) et 310 mOsm. Conserver à 4 °C jusqu’à l’utilisation. Bon pour plusieurs semaines.
- Préparez une solution d’enregistrement intracellulaire avec de la nystatine de manière extemporanée (à la dernière minute) avant l’expérience.
- Peser 3 mg de nystatine, ajouter 50 μl de diméthylsulfoxyde (DMSO) ; tourbillonner 20 secondes puis sonicer 2-3 min jusqu’à ce qu’il soit entièrement dilué.
- Ajouter 20 μl de solution de DMSO-nystatine dans 5 ml de solution mère intracellulaire. Vortex 20 sec, puis sonicate 3 min. Conservez cette solution à 4 °C et protégez-la de la lumière directe, la nystatine est sensible à la lumière. Cette solution peut être utilisée pendant quelques heures. Remplacez tous les jours.
- Une fois la préparation de l’épithélium olfactif passée au microscope, prélever une partie de cette solution dans une seringue de 1 ml avec un embout jaune allongé à la flamme pour remplir les électrodes ; à l’abri de la lumière directe. Une fois à température ambiante (RT), la solution de nystatine n’est pas stable ; Remplacez la solution dans la seringue de 1 ml toutes les heures ou conservez-la dans de la glace.
- Tirez les électrodes d’enregistrement avec un extracteur pour obtenir un long col et une petite pointe (~2 μm) avec une résistance de 15-20 MΩ avec la solution interne de nystatine.
- Préparer une solution odorante à 0,5 M dans du DMSO sous hotte, aliquote et maintenir à -20 °C jusqu’à l’utilisation. Diluer l'odorant dans la solution de Ringer jusqu'à la concentration désirée. Remplissez la pipette stimulante.
3. Préparation de l’épithélium olfactif
Remarque : Les souris OR-IRES-tauGFP expriment le tauGFP sous le contrôle du promoteur OR. Chez ces souris, tous les neurones exprimant l’OR d’intérêt sont marqués avec la GFP. Ce protocole est adapté pour les RO exprimés dans toutes les zones. Cependant, les dissections et les enregistrements sont plus faciles pour les RC exprimés dans la zone dorsale.
- Anesthésier l’animal en lui injectant un mélange de kétamine et de xylazine (150 mg/kg et 10 mg/kg de poids corporel, respectivement). La décapitation peut être effectuée avec des ciseaux tranchants pour les jeunes souris ou avec une guillotine de rongeur correctement entretenue pour les souris plus âgées.
- À l’aide de ciseaux de dissection annulaire, faites une incision médiale longitudinale à travers la peau dorsale. Retirez la peau en la séparant. À l’aide des ciseaux, coupez les mâchoires inférieures au niveau de l’articulation de la mâchoire. Retirez les dents antérieures supérieures par une coupe coronale parallèle aux dents.
- Faites une coupe coronale de la tête derrière les yeux et ne gardez que la partie antérieure de la tête. Trempez-le dans une solution Ringer glacée pour la dissection sous l’endoscope.
- Disséquer sous la lunette : dans la face ventrale, faire une coupe longitudinale le long de la mâchoire supérieure/des dents. Coupez les os dorsaux longitudinalement, en suivant le côté dorsolatéral de la cavité nasale. Retirez la plupart des arêtes et du palais ; transférer le septum et l’épithélium qui y est attaché dans du Ringer oxygéné à la RT.
- Pour la dissection finale : Juste avant de commencer la session d’enregistrement, retirez l’épithélium du septum sous-jacent à l’aide d’une pince. Détachez l’épithélium à l’aide d’une pince et de deux ciseaux de 4 à 5 mm (utilisez des ciseaux micro-vannas) au niveau de la partie antérieure du septum où l’adhérence est plus forte.
- Retirez soigneusement l’organe voméronasal en le coupant le long de sa connexion dorsale à l’épithélium septal. Transférez l’épithélium dans une chambre d’enregistrement avec la couche de mucus vers le haut ; Gardez-le à plat dans la chambre avec une harpe.
- Installez la chambre sous un microscope droit équipé d’une optique de fluorescence et d’une caméra sensible. Visualisez la préparation sur l’écran de l’ordinateur à fort grossissement grâce à un objectif à immersion dans l’eau 40X (ouverture numérique 0,8) et à un grossissement supplémentaire de 2X ou 4X obtenu par une loupe. Perfuser en continu avec une sonnerie oxygénée à RT (1-2 ml/min).
4. Enregistrement de la session
- Recherche de cellules fluorescentes : exciter la préparation à 480 nm pour l’EGFP, qui émet de la lumière dans la gamme 530-550 nm ; cibler un bouton dendritique qui est visible de manière fiable en fluorescence et en fond clair.
- Remplissez l’électrode d’une solution intracellulaire de nystatine ; éliminez les bulles en tapotant doucement sur l’électrode.
- Insérez l’électrode sur le porte-électrode, appliquez une pression positive dans la pipette ; La résistance doit être de 15-20 MΩ.
- Approchez l’électrode de la cellule ; une fois que la résistance atteint ~40 MΩ, relâchez la pression positive et appliquez une légère pression négative pour atteindre un gigaseal.
- Une fois l’étanchéité atteinte, réglez le potentiel de membrane à environ -75 mV ;
- Une fois la cellule ouverte, procédez aux protocoles de stimulation, aux traitements pharmacologiques. Pour mesurer la réponse à une seule stimulation odorante, enregistrez 200 à 500 ms d’activité spontanée, stimulez pendant 500 ms et mesurez la réponse de la cellule jusqu’à 10 secondes. Pour les traitements pharmacologiques, perfuser les agents pharmacologiques à la concentration souhaitée.
