Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Alignement du chemin optique entre la caméra CMOS (semi-conducteur à oxyde métallique complémentaire) et le cordon de raccordement individuel ou ramifié
- Desserrez toutes les vis du traducteur 5 axes (Figure 1B).
- Vissez le cordon de raccordement (Figure 1B) à l’adaptateur [SMA (A) subminiature] ou FC (connecteur à fibre optique)] fixé au traducteur 5 axes.
- Allumez le voyant d’excitation de 470 nm (Figure 1B) à faible puissance (100 μW) et placez l’extrémité du cordon de raccordement vers une diapositive en plastique autofluorescente. Cela n’a aucune incidence sur les enregistrements futurs, mais sert uniquement à visualiser le processus d’alignement.
- Enregistrez à partir de la caméra CMOS (Figure 1B) en mode direct. Augmentez le gain ou ajustez la table de correspondance (LUT) jusqu’à ce que l’image ne soit pas entièrement noire. Le but est de pouvoir voir une image au foyer de l’objectif (Figure 1B).
- Faites avancer le traducteur à 5 axes vers l’objectif, en vous assurant que la lumière de 470 nm est centrée sur la fibre à l’extrémité SMA ou FC du cordon de raccordement jusqu’à ce qu’une image puisse être résolue sur la caméra.
- Ajustez les axes X et Y jusqu’à ce que l’image soit centrée et bien résolue.
- Visualisez la lumière émise par l’extrémité de la virole du cordon de brassage. Il doit apparaître sous la forme d’un cercle isotrope. Si un cordon de raccordement ramifié est utilisé, la quantité de lumière émise aux extrémités de chaque cordon de raccordement doit être similaire. Si le cercle n’est pas isotrope ou si la lumière émise est inégale, ajustez le traducteur à 5 axes dans l’axe X-Y.
2. Configuration des zones d’intérêt autour des fibres pour la mesure de l’intensité moyenne de fluorescence
- Allumez tous les voyants d’excitation pour mieux visualiser les fibres. Ajustez le gain de la caméra de manière à ce qu’aucun pixel ne soit saturé et qu’une image claire des fibres soit présente.
- Enregistrez en direct ou prenez une image préliminaire.
- Dessinez des zones d’intérêt autour des fibres et conservez-les pour mesurer les valeurs d’intensité moyenne pendant les enregistrements (Figure 1A).
- Pour les enregistrements à fibres multiples, testez l’indépendance des signaux.
- Enregistrement en direct de toutes les fibres.
- Pointez une fibre vers une source lumineuse et tapotez avec un doigt. De grandes fluctuations ne doivent se produire que dans ce canal (fuite acceptable 1:1000).
- Si les signaux ne sont pas indépendants, redessinez des retours sur investissement plus conservateurs et répétez le test d’indépendance.
- Pour étiqueter et suivre quel retour sur investissement correspond à quelle fibre, ruban adhésif coloré ou vernis à ongles peut être appliqué à l’extrémité des fibres. Prenez une photo avant le début de toute expérience comme rappel secondaire.
3. Configuration de l’arène d’enregistrement
- Accrochez le cordon de raccordement au-dessus de l’arène à l’aide de supports, de pinces ou de supports.
- Assurez-vous que l’animal peut se déplacer librement dans toute l’arène, sans être gêné par la longueur de la fibre.
- Si une boîte opérante ou un champ ouvert est utilisé, assurez-vous que le cordon de raccordement peut atteindre l’animal avec une flexion minimale. Si cela nécessite un coup de nez, assurez-vous qu’il y a suffisamment d’espace au-dessus de la tête pour empêcher la flexion de la fibre. Évitez de plier ou de tordre excessivement le cordon de brassage.
4. Enregistrements in vivo
- Inspectez visuellement l’extrémité distale des fibres du cordon de raccordement à l’œil nu et à l’aide d’un microscope à minifibres. Si la surface des fibres est rayée, repolissez les fibres à l’aide d’un film de polissage/rodage des fibres à grain fin (1 μm et 0,3 μm).
- Nettoyez les extrémités distales du cordon de brassage avec de l’éthanol à 70 % et un coton-tige.
- Nettoyez les canules à fibre optique à l’aide d’éthanol à 70 % et d’un applicateur à embout coton.
- Connectez l’extrémité de la virole du cordon de brassage à la fibre implantée à l’aide d’un manchon fendu en céramique recouvert d’un tube rétractable noir. Assurez-vous que le manchon est bien serré lors de la connexion. Sinon, utilisez un nouveau sleeve.
note: S’il y a un espace entre la virole du cordon de raccordement et l’implant, il y aura une grande perte de signal et les enregistrements ne fonctionneront pas.
- Laissez l’animal récupérer pendant quelques minutes avant le début des tests comportementaux.
- Lancez l’enregistrement du signal optique et exécutez l’expérience.
- Pendant l’enregistrement, gardez un œil attentif sur le live-trace pour garantir des enregistrements de qualité. On s’attend à ce que le signal diminue rapidement en fonction du temps au cours des 2 premières minutes d’enregistrement. Cet effet est causé par la décroissance des LED médiée par la chaleur, par laquelle l’augmentation de la chaleur augmente la résistance de l’élément optique.
- Si un saut dans le signal qui dépasse la cinétique marche/arrêt de GCaMP se produit, cela indique souvent que le manchon n’est pas assez serré et que l’espace entre le cordon de raccordement et l’implant change. Dans ce cas, arrêtez l’expérience et reconnectez l’animal à l’aide d’un nouveau manchon.
