Une étude électrophysiologique des synapses de rétinogéniculate et de corticogéniculate dans des tranches de cerveau de souris

Résumé

Source : Chen, X., et al. Investigations électrophysiologiques de la fonction synaptique du rétinogéniculate et du corticogéniculate. J. Vis. Exp. (2019).

La vidéo décrit l’enregistrement électrophysiologique des synapses de rétinogéniculate et de corticogéniculate dans des tranches de cerveau de souris. Les tranches contenant le noyau géniculé latéral dorsal (dLGN) sont placées dans une chambre d’enregistrement. Une pipette stimulante est positionnée soit sur le tractus optique pour stimuler les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) et étudier les synapses rétinogéniculées, soit sur le noyau réticulaire thalami pour stimuler les neurones corticaux et étudier les synapses corticogéniculées. Lors de la stimulation, les RGC et les neurones corticaux libèrent des neurotransmetteurs excitateurs, qui produisent des courants synaptiques dans les neurones relais LGN. Ces courants sont enregistrés à l’aide d’une pipette enregistreuse à pince patch.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Solutions

1. Solution de dissection
   1. Pour réduire l’excitotoxicité, préparez une solution à base de choline à utiliser lors de la dissection, comme indiqué ici (en mM) : 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 chlorure de choline, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 0,5 CaCl₂, 7 MgCl₂ et 25 glucose. Préparez la solution de dissection moins d'1 semaine avant l’expérience.
2. Solution d’enregistrement
   1. Préparez une solution de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant (en mM) : 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ et 25 glucose. Ajouter 50 μM d’acide D-2-amino-5-phosphonovalérique (D-APV) et 10 μM de bromhydrate SR 95531 (gabazine) pour bloquer les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et GABAA, respectivement.
3. Solution intracellulaire
   1. Préparez une solution intracellulaire contenant (en mM) : 35 Cs-gluconate, 100 CsCl, 10 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES), 10 acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA) et 0,1 D-600 (chlorhydrate de méthoxyvérapamil). Ajustez le pH à 7,3 avec du CsOH. Filtrez, aliquote et conservez la solution mère à -20 °C jusqu’à utilisation.

2. Dissection

1. Préparez deux chambres de coupe, dont l’une est remplie de 100 mL de solution de dissection et l’autre de 100 mL de solution d’enregistrement. Placez les deux béchers dans un bain-marie (37 °C) et faites bouillir les solutions avec du carbogène pendant au moins 15 minutes avant la dissection.
2. Remplissez un bécher en plastique avec 250 ml de solution de dissection presque glacée (mais pas congelée). Buller au carbogen au moins 15 min avant utilisation.
3. Remplissez une boîte de Pétri en plastique (100 mm x 20 mm), dans laquelle la dissection cérébrale sera effectuée, avec la solution de dissection froide. Placez un morceau de papier filtre dans le couvercle de la boîte de Pétri.
4. Refroidissez la chambre de dissection du vibratome.
5. Anesthésier une souris avec de l’isoflurane à 2,5 %, par exemple dans la cage de la souris. Dès que la souris ne répond pas à un pincement de la queue, décapitez la souris près de la moelle cervicale et plongez la tête dans la solution de dissection glacée à la base de la boîte de Pétri
.
6. Coupez la peau de la tête de la caudale au nasal et maintenez-la latéralement avec les doigts pour exposer le crâne. Pour retirer le cerveau antérieur, coupez d’abord le crâne avec la ligne médiane postéro-antérieure, puis coupez deux fois de plus à travers la suture coronale et la suture lambdoïde (Figure 1A).
7. Retirez le crâne entre la suture coronale et la suture lambdoïde de manière à ce que le cerveau soit exposé. Coupez le bulbe olfactif et séparez le cerveau antérieur du mésencéphale à l’aide d’une lame fine (Figure 1B). Retirez la cervelle du crâne à l’aide d’une spatule fine et placez-la sur le papier filtre dans le couvercle de la boîte de Pétri.
   note: Les étapes 2.6 et 2.7 doivent être effectuées le plus rapidement possible pour réduire la mort cellulaire.
8. Pour préserver l’intégrité des entrées sensorielles et corticales du dLGN dans la tranche de cerveau, séparez les deux hémisphères par une coupe parasagittale d’un angle de 3−5° (Figure 1C, D). Séchez les plans médiolatéraux des deux hémisphères en les plaçant sur le papier filtre, puis collez-les sur l’étage de coupe avec un angle de 10−25° par rapport au plan horizontal (Figure 1E).
9. Placez la platine au centre du plateau tampon métallique et versez doucement le reste de la solution de dissection glacée dans le plateau tampon. Effectuez cette étape avec précaution, car une forte coulée peut enlever le cerveau collé (Figure 1F).
10. Placez le bac tampon dans le bac rempli de glaçons, ce qui aide à maintenir la basse température pendant la dissection. Coupez des tranches de 250 μm avec une lame de rasoir à une vitesse de 0,1 mm/s et une amplitude de 1 mm.
11. Conservez les tranches dans la chambre de rétention remplie de solution de dissection oxygénée à 34 °C pendant environ 30 minutes, puis laissez les tranches se rétablir dans la solution d’enregistrement à 34 °C pendant encore 30 minutes.
12. Après la récupération, retirez la chambre de maintien des tranches du bain-marie et conservez les tranches à température ambiante (RT) jusqu’à ce qu’elles soient utilisées dans des expériences.

3. Électrophysiologie

1. Tirez les pipettes à l’aide de capillaires en verre borosilicaté et d’un extracteur de filament. Maintenir la résistance des pipettes enregistreuses à 3−4 MΩ. Tirez les pipettes stimulantes en utilisant le même protocole mais cassez légèrement la pointe après avoir tiré pour augmenter le diamètre. Remplissez les pipettes d’enregistrement avec la solution intracellulaire et la biocytine, tout en remplissant les pipettes de stimulation avec la solution d’enregistrement.
2. Placez les tranches dans la chambre d’enregistrement et perfusez-les continuellement avec une solution d’enregistrement oxygénée à RT. Vérifiez toutes les tranches et sélectionnez celles qui présentent un conduit optique intact.
3. Visualisez la coupe et les cellules à l’aide d’un microscope droit équipé d’une microscopie vidéo à contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC).
   note: Les neurones relais se différencient des interneurones par leur plus grande taille de soma et leurs dendrites plus primaires (branches émergeant du soma). Les interneurones présentent une morphologie bipolaire avec un soma plus petit.
4. Placez la pipette stimulante sur la tranche avant de patcher la cellule avec la pipette d’enregistrement. Pour étudier les synapses rétinogéniculées, placez la pipette de stimulation directement sur le tractus optique, où les fibres axonales des cellules ganglionnaires de la rétine sont regroupées (Figure 2A). Pour analyser les synapses corticogéniculées, placez l’électrode de stimulation sur le noyau réticulaire thalami, qui est rostro-ventralement adjacent au dLGN (Figure 2B).
5. Une fois la pipette d’enregistrement immergée dans la solution d’enregistrement, appliquez un pas de tension de 5 mV pour surveiller la résistance de la pipette. Réglez le potentiel de maintien sur 0 mV et annulez le potentiel de décalage de sorte que le courant de maintien soit de 0 pA.
6. Approchez-vous de la cellule avec la pipette d’enregistrement tout en appliquant une pression positive. Lorsque la pipette est en contact direct avec la membrane cellulaire, relâchez la pression positive et réglez le potentiel de maintien sur -70 mV. Appliquez une légère pression négative pour permettre à la membrane cellulaire de se fixer à la pipette en verre de sorte qu’un joint gigaohm se forme (résistance >1 GΩ). Compensez la capacité de la pipette et ouvrez la cellule par l’application d’impulsions de pression négative.
7. Pour étudier la fonction synaptique, appliquez des impulsions de courant de 0,1 ms (environ 30 μA) via la pipette de stimulation. Si aucune réponse synaptique n’est observée, il peut être nécessaire de remplacer les pipettes de stimulation. Soyez prudent lorsque vous placez les pipettes de stimulation dans une position différente afin de ne pas perdre la cellule enregistrée.
   note: Dans les exemples d’enregistrements présentés à la figure 2, la plasticité synaptique à court terme a été étudiée en stimulant le tractus optique ou les fibres corticogéniculées à deux reprises avec des intervalles inter-stimulus de 30 ms. Le rapport d’impulsions appariées (PPR) a été calculé en divisant l’amplitude du deuxième courant postsynaptique excitateur (EPSC) par celle du premier EPSC (EPSC2/EPSC1). Chaque protocole de stimulation a été répété 20 fois. L’amplitude de l’EPSC a été mesurée à partir des courants moyens des 20 balayages. L’intervalle de temps entre chaque répétition était d’au moins 5 s pour éviter la plasticité à court terme induite par les répétitions.
8. Surveillez en permanence la résistance série en appliquant une tension de 5 mV. N’utilisez que les cellules dont la résistance série est inférieure à 20 MΩ pour l’analyse.

Résultats

Graphique 1 : Schémas représentant le protocole de dissection. (A) Vue horizontale du crâne de la souris, montrant la position des coupes initiales. La première coupe a été effectuée avec la suture sagittale, suivie de deux autres coupes avec la suture coronale et la suture lambdoïde, respectivement. Les lignes pointillées représentent les incisions. (B) Vue s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
amplificateur	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Amplificateur à double pince de patch
CaCl2	ASSURER	Référence 1.02382.1000
chlorure de choline	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Microscope confocal à balayage laser	Microsystèmes Leica	TCS SP5
CsCl	ASSURER	Référence 1.02038.0100
Cs-gluconate	Auto-préparé		Comme il n’y avait pas de Cs-gluconate commercial, nous l’avons préparé nous-mêmes
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG
D-APV	Biotendance	Référence : BN0085-100
Appareil photo numérique pour microscope O	Olympe	XM10
EGTA	SERVA	Référence 11290.02
glucose	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	Roth	Référence 9105.2
Isolateur de stimulus de courant élevé	Instruments de précision mondiaux	A385
Kcl	ASSURER	Référence 1.04936.1000
MgCl2	ASSURER	Référence 1.05833.0250
Micromanipulateurs	Luigs et Neumann	Le SM7
Miroscope	Olympe	BX51
Milieu de montage	ThermoFisher Scientific	Réf. P36930
NaCl	Roth	Référence 3957.1
NaH2PO4	ASSURER	Référence 1.06346.1000
NaHCO3	ASSURER	Référence 1.06329.1000
pipette	Hilgenberg	1807502
Extracteur	Sutter	P-1000
lame	Personna	Référence 60-0138
Vibratome semi-automatique	Leica Biosystems	VT1200S
SR 95531 bromhydrate	Biotendance	AOB5680-10	Antagoniste des récepteurs GABAA