Implantation d’un système de microélectrodes bidirectionnelles sans fil dans le cerveau d’un rat

Abstract

Source : Melo-Thomas, L., et al., Une interface bidirectionnelle sans fil pour l’enregistrement in vivo et la stimulation de l’activité neuronale chez des rats se comportant librement. J. Vis. Exp. (2017)

La vidéo montre une procédure d’implantation d’une unité d’électrode multicanal bidirectionnelle sans fil dans le cerveau d’un rat pour enregistrer et stimuler des réseaux neuronaux multicanaux.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Animaux

1. Hébergez des rats Wistar mâles adultes (200-250 g) en groupes de 3-4 dans des conditions de laboratoire standard pendant au moins une semaine avant la chirurgie pour permettre l’acclimatation.
2. Deux jours après l’opération, des rats domestiques par paires. Couvrez les cages individuelles avec de hauts couvercles en acrylique. Évitez les couvercles conventionnels en grille métallique, car les implants peuvent se coincer, ce qui augmente le risque qu’ils soient endommagés et/ou instables au fil du temps.

2. Chirurgie stéréotaxique

1. Avant de commencer la chirurgie, organisez et préparez l’équipement et le matériel suivants :
   1. Procurez-vous du matériel chirurgical stérile composé de ciseaux stériles, de pinces à bout émoussé, de spatules, de tondeuses chirurgicales, d’une perceuse dentaire et d’cotons-tiges.
   2. Procurez-vous des médicaments et des produits chimiques, notamment de l’isoflurane, de la xylocaïne, du chlorhydrate de tramadol, du baume ophtalmologique dexpantenol, du peroxyde d’hydrogène à 3 %, de la povidone iodée et de l’éthanol à 70 %.
   3. Procurez-vous du matériel de fixation, y compris des vis en acier inoxydable, de la résine acrylique, de la colle ultraviolette et un protecteur de capuchon.
   4. Obtenir une unité de microélectrode, composée (i) d’une électrode unique d’enregistrement (microélectrode en platine tungstène isolée en verre de quartz, de forme conique, diamètre extérieur : 80 μm, pointe conique, impédance à 1 kHz : 500 kOhm) ou d’une tétrode (microélectrode 4 cœurs en platine/tungstène isolée en verre de quartz, diamètre extérieur : 100 μm, pointe conique, impédance à 1 kHz : 500 à 800 kOhm) ; (ii) une électrode de stimulation (fil de platine/iridium (90 % de platine, 10 % d’iridium), diamètre du noyau 125 μm, diamètre extérieur 150 μm, impédance <10 kOhm) reliée à une plaque de contact et (iii) une électrode de référence en fil de platine (diamètre de l’arbre, 100 μm ; Figure 1A).
   5. Procurez-vous un porte-électrode collé avec de la colle soluble dans l’eau sur l’unité de microélectrode et testez le fonctionnement au moins 2 h à l’avance (Figure 1B).
   6. Procurez-vous un système captif conventionnel composé d’un préamplificateur différentiel, d’un amplificateur principal et d’un amplificateur à filtre passe-bande pour les enregistrements.
   7. Procurez-vous du matériel supplémentaire, comme des gants, un coussin chauffant, des seringues et une solution saline physiologique.
   8. Procurez-vous des cages domestiques (L x l x H : 42 cm x 26 cm x 38 cm).
2. Procédure
   REMARQUE : L’implantation d’électrodes est réalisée lors d’une chirurgie stéréotaxique conventionnelle sous anesthésie isoflurane.
   1. Assurez-vous que l’expérimentateur porte des gants, un masque chirurgical et une blouse de laboratoire.
   2. Amorcer l’anesthésie en plaçant l’animal dans une chambre d’induction (isoflurane 4-5 %, débit d’oxygène 1 L/min, durée ~5 min).
   3. Testez la perte de réflexes (réflexes de la queue et des orteils) avec des pinces pour confirmer une anesthésie profonde.
   4. Placez la tête de l'animal dans un masque d'anesthésie fixé autour de la barre incisive supérieure du cadre stéréotaxique et ajustez l'anesthésie (isoflurane 2-3 %, débit d'oxygène 0,7-0,8 L/min).
   5. Fixez et alignez horizontalement la tête de l'animal dans l'appareil stéréotaxique à l'aide de barres d'oreille et d'une barre d'incisive supérieure.
   6. Rasez le champ opératoire à l’aide d’une tondeuse chirurgicale ou d’un ciseau et stérilisez avec de la povidone iodée.
   7. Placez l’animal sur un coussin chauffant pour prévenir l’hypothermie et traitez les yeux avec un baume pour les yeux au dexpanthénol pour les empêcher de se dessécher.
   8. Injecter de la xylocaïne (0,3-0,4 mL, par voie sous-cutanée, s.c.) au centre du champ opératoire.
   9. Testez à nouveau la perte de réflexes.
   10. Faites une petite incision (1,5 cm) avec un scalpel au milieu du champ opératoire pour exposer le crâne. Séparez doucement la peau et retirez les tissus résiduels à l’aide d’une pince, de ciseaux et d’une spatule.
   11. Nettoyez soigneusement le crâne à l’aide de cotons-tiges enduits de peroxyde d’hydrogène.
   12. Percez 4 à 5 petits trous (4,7 mm) dans le crâne pour la fixation des vis en acier inoxydable.
   13. Connectez l’unité de microélectrode/le support d’électrode au préamplificateur et fixez-le au micromanipulateur stéréotaxique (Figure 1B et 1C).
   14. Percez un trou (environ 7 mm) dans le crâne au-dessus de la zone cible à l’aide des coordonnées d’un atlas cérébral en fonction de l’animal utilisé. Dans la présente étude, positionnez les pointes des électrodes dirigées vers le colliculus inférieur à l’aide des coordonnées suivantes, le bregma servant de référence : antérieur/postérieur, −8,8 mm ; médial/latéral, 1,5 mm ; et dorsale/ventrale, 3,5 mm.
   15. Absorbez le sang avec des cotons-tiges.
   16. Introduisez verticalement l’unité de microélectrode jusqu’à ce que les pointes des électrodes atteignent la zone cible.
   17. Positionnez le câble de terre le long des vis en acier inoxydable et sous la peau.
   18. Surveillez l’activité des pointes et ajustez soigneusement la position de l’électrode avec le micromanipulateur jusqu’à ce qu’elles atteignent une zone de neurones actifs dans la structure cible et détectez l’activité neuronale avec un rapport signal/bruit adapté au tri des pointes.
   19. Fixez l’unité de microélectrode au crâne avec de la colle ultraviolette et recouvrez la plaque de contact et les vis de résine acrylique.
   20. Injecter une solution saline physiologique (1 mL i.p.) et du tramadol (25 mg/kg, s.c.) pour prévenir la déshydratation et assurer une analgésie postopératoire, respectivement.
   21. Débranchez l’unité de microélectrode du porte-électrode à l’aide d’une brosse imbibée d’eau.
   22. Arrêtez l’anesthésie et retirez soigneusement le rat du cadre stéréotaxique. Débranchez le préamplificateur de l’unité de microélectrode.
   23. Connectez la protection du capuchon sur l’unité de microélectrode implantée et déconnectez-la uniquement pendant les procédures expérimentales.

Results

Graphique 1 : Unité de microélectrode TWS. (1) électrode/tétrode unique d’enregistrement, (2) électrode de stimulation, (3) carte de connexion à fibre d’électrode, (4) câbles de connexion flexibles, (5) fil de terre, (6) carte de connexion, (7) connecteur mâle ou femelle pour système TWS (A) ; unité de microélectrode TWS connectée au préamplificateur (8) et au support (9) ; (<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Système sans fil Thomas (TWS) version 2.0	Thomas RECORDING GmbH	AN001165	Le système sans fil Thomas (TWS) version 2.0 est un système de télémétrie multicanal portable avec un ordinateur portable, un système d’exploitation Microsoft Windows préinstallé et un logiciel de contrôle TWS. Le TWS comprend : un amplificateur principal programmable et pré- à 4 canaux à faible bruit avec une bande passante fixe, un stimulateur à courant constant monocanal pour l’application d’impulsions de courant biphasique, un microstimulateur programmable par logiciel, un système de connecteur implantable et une unité de tête de base pour le montage sur un animal. Le système est livré avec un émetteur-récepteur avec connexion au port USB pour les ordinateurs portables ou les ordinateurs personnels de bureau, le logiciel de contrôle fonctionnant sous le système d’exploitation Microsoft Windows. Le système TWS peut être utilisé pour la stimulation neuronale extracellulaire et l’enregistrement chez de petits animaux au comportement libre (par exemple, des rats, des cochons d’Inde). Ce système peut également être adapté pour être utilisé chez des animaux plus grands (par exemple les primates).
Logiciel pour Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	inclus dans AN001165	Le logiciel du système sans fil Thomas fonctionne sous le système d’exploitation Microsoft Windows et fournit l’interface utilisateur graphique (GUI) pour le système sans fil Thomas (TWS). L’interface graphique TWS offre un contrôle complet des fonctions TWS : enregistrement à 4 canaux et stimulation à 1 canal.
Tétrode implantable pour l’enregistrement (4 canaux) et la stimulation (monocanal)	Thomas RECORDING GmbH	AN001132	Tétrode implantable pour l’enregistrement (4 canaux) et la stimulation (monocanal) pour une utilisation avec Thomas Wireless Systems (TWS). Spécifications de la tétrode d’enregistrement : matériau de la fibre de tétrode : fibre de tungstène de platine isolée en verre de quartz, diamètre extérieur de la fibre de tétrode : 100μm, forme de la pointe D, impédance 0,5-0,8MOHm ; Électrode de référence : forme de la pointe : D ; Impédance : 300-500kOhm ; Matériau : platine/tungstène isolé en verre de quartz ; Spécification de l’électrode de stimulation : matériau de la fibre : platine/iridium, diamètre : 125μm, laqué isolé, forme de l’embout : D, impédance : < 10kOhm, les dimensions de l’électrode peuvent être spécifiées par l’utilisateur final
Microélectrode implantable pour l’enregistrement (monocanal) et la stimulation (monocanal)	Thomas RECORDING GmbH	AN001118	Microélectrode implantable pour l’enregistrement (monocanal) et la stimulation (monocanal) pour une utilisation avec Thomas Wireless Systems (TWS). Spécifications de l’électrode d’enregistrement : matériau de la fibre d’électrode : fibre de tungstène de platine isolée en verre de quartz, diamètre extérieur de la fibre d’électrode : 80 μm / 250 μm (veuillez préciser), forme de la pointe D, impédance 0,5-0,8MOHm ; Électrode de référence : forme de la pointe : D ; Impédance. 300 à 500 kOhm ; Matériau : platine/tungstène isolé en verre de quartz ; Spécification de l’électrode de stimulation : matériau de la fibre : platine/iridium, diamètre : 125μm, laqué isolé, forme de l’embout : D, impédance : < 10kOhm
Support pour l’implantation d’électrodes	Thomas RECORDING GmbH	AN000838	Tige métallique pliée spéciale pour l’implantation de microélectrodes pour les porte-électrodes standard. La tige sert à maintenir une électrode implantable. L’électrode implantable est fixée à la tige à l’aide d’une colle spéciale soluble dans l’eau Thomas RECORDING (AN001080). (Le porte-électrode n’est pas inclus)
Alimentation à accumulateur de remplacement pour le système sans fil Thomas (3,7V/230mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001208	Batterie rechargeable de remplacement (accumulateur) pour le système sans fil Thomas d’une capacité de 230 mA pour une durée de fonctionnement d’environ 1 heure. (taille : 27 mm x 20 mm x 6 mm, poids environ 6 g)
Alimentation à accumulateur de remplacement pour le système sans fil Thomas (3,7V/450mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001209	Batterie rechargeable de remplacement (accumulateur) pour système sans fil Thomas d’une capacité de 450mA pour plus de 1h de fonctionnement. (taille : 48 mm x 30 mm x 4 mm, poids environ 11 g)
Chargeur d’accumulateur pour accumulateur rechargeable Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	AN001207	Chargeur secteur pour accumulateurs rechargeables Thomas Wirless System (TWS) (AN001209 et AN001209)
Colle soluble dans l’eau	Thomas RECORDING GmbH	AN001080	La colle pour électrodes solubles dans l’eau Thomas RECORDING est un produit spécialement sélectionné pour être utilisé avec des microélectrodes implantables dans la recherche neuroscientifique. Ses propriétés uniques assurent une connexion rigide entre l’électrode et le dispositif de montage, bien qu’il soit facilement amovible à l’eau chaude. La colle à électrode soluble dans l’eau Thomas RECORDING peut être utilisée prête à l’emploi, sans aucune préparation fastidieuse. La colle d’électrode soluble dans l’eau Thomas RECORDING n’est pas nocive pour l’homme, les animaux ou l’environnement. Quantité : 1 boîte de 10 grammes
Préamplificateur différentiel miniature	Thomas RECORDING GmbH	AN000329	Le préamplificateur différentiel miniature, modèle MDPA-2, est un préamplificateur d’entrée différentielle à 2 canaux conçu pour les enregistrements à faible bruit à partir de tissus excitables. Il est destiné à l’enregistrement extracellulaire en conjonction avec l’implantation de microélectrodes implantables pour des applications animales en mouvement libre avec le système sans fil Thomas (TWS). Le préamplificateur différentiel miniature à 2 canaux (MDPA-2) est connecté aux microélectrodes implantables pour fournir l’étage d’amplification initial décuplé. Idéalement, les électrodes en platine/tungstène isolées en verre de quartz Thomas RECORDING sont utilisées pour obtenir des résultats d’enregistrement optimaux avec des amplitudes de signal élevées et de faibles niveaux de bruit. Le MDPA-2 dispose d’entrées supplémentaires d’électrodes de masse et de référence.
Câble de raccordement	Thomas RECORDING GmbH	AN000330	Câble de connexion pour connecter le préamplificateur différentiel Thomas Miniature (MDPA-2) à un amplificateur principal et à une alimentation par accumulateur.
Alimentation rechargeable pour le préamplificateur miniature	Thomas RECORDING GmbH	AN000328	Alimentation à accumulateur rechargeable pour le préamplificateur différentiel miniature (MDPA-2).
Chargeur d’accumulateur (US)	Thomas RECORDING GmbH	AN000167	Chargeur d’accumulateur pour le AN000328 d’alimentation électrique (connecteur de prise de courant secteur US)
Chargeur d’accumulateur (EU)	Thomas RECORDING GmbH	AN000168	Chargeur d’accumulateur pour le AN000328 d’alimentation électrique (connecteur de prise secteur UE)
Préamplificateur différentiel/amplificateur principal/filtre passe-bande	Thomas RECORDING GmbH	AN000677	L’amplificateur principal TREC AC (LabAmp-03) est un amplificateur principal différentiel monocanal pour des applications neurophysiologiques (par exemple, l’enregistrement extracellulaire avec des microélectrodes). Cet instrument est conçu pour fonctionner avec le préamplificateur différentiel miniature, modèle MDPA-2. Le canal unique du LabAmp-03 contient un étage d’amplification différentiel à gain élevé et à faible bruit, suivi de filtres basse fréquence et haute fréquence. L’amplificateur dispose de deux amplificateurs de filtre différents, un filtre d’activité unitaire (SUA) et un amplificateur de filtre de potentiel de champ local (LFP), tous deux connectés parallèlement dans le chemin du signal. Le mode d’enregistrement offre deux niveaux de gain du signal (x10, x100) dans un premier étage et 4 niveaux supplémentaires (x5, x10, x25 et x50) dans un dernier étage d’amplification. Chaque amplificateur a des caractéristiques passe-bande différentes pour une activité unitaire (SUA) 500Hz...20kHz et des potentiels de champ local (LFP) 0,1Hz...140Hz. Un moniteur audio et un discriminateur de fenêtre sont intégrés dans l’appareil. Le LabAmp-03 dispose d’un moniteur audio intégré avec haut-parleur. Cette unité assure la reproduction audio des signaux électrophysiologiques. L’unité combine un amplificateur audio dans un boîtier compact et robuste. Ceci est particulièrement adapté à la surveillance de l’activation neuronale et des contractions musculaires. L’entrée du moniteur audio est connectée en interne à la sortie de l’amplificateur SUA-Filter. Le LabAmp-03 est livré avec une alimentation externe pour une plage de tension de fonctionnement sur secteur de 100-240V AC/50-60Hz.
Oscilloscope USB	Thomas RECORDING GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. Cet oscilloscope PC à 2 canaux est parfaitement adapté à une utilisation mobile sur un ordinateur portable et à une installation permanente dans des armoires de commande, des équipements industriels et de nombreuses autres applications où un oscilloscope petit, léger et puissant est requis. Cet oscilloscope est connecté à la sortie du signal de l’amplificateur principal pour l’affichage de l’activité extracellulaire enregistrée lors de l’implantation des microélectrodes implantables pour le système sans fil Thomas (TWS). L’utilisateur peut acquérir les données de mesure via les différentes interfaces de données directement sur le PC avec un logiciel PC inclus.
Générateur de stimulus	Systèmes multicanaux	STG3008-FA	Le générateur de stimulus pour la stimulation en courant (STG) et la stimulation en tension remplissent trois fonctions : stimulation pilotée par le courant, stimulation pilotée par la tension, contrôle et synchronisation. Le STG est disponible avec 2, 4 ou 8 canaux de sortie indépendants. Doté d’unités d’isolation intégrées pour chaque canal de sortie, le STG est capable de fournir n’importe quelle forme d’onde arbitraire.
Protecteur de capuchon pour l’électrode	Thomas RECORDING GmbH	AN001193	Capuchon de protection pour unité d’électrode implantable pour le système sans fil Thomas
Matériel chirurgical			Ciseaux, pinces à bout émoussé, spatules, tondeuses chirurgicales, forets dentaires et cotons-tiges
Médicaments et produits chimiques			Isoflurane, xylocaïne, chlorhydrate de tramadol (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Allemagne), baume ophtalmique expantenol (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Allemagne), peroxyde d’hydrogène à 3 %, povidone iode (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limbourg, Allemagne) et 70 % d’éthanol ;
Matériel de fixation comprenant			Vis en acier inoxydable (BN650 M1.2x5 ; 4,7 mm), résine acrylique (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Allemagne), colle ultraviolette (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Allemagne) et protecteur de capuchon (Thomas Recording GmbH, Giessen, Allemagne) ;
Matériel supplémentaire			Gants, coussin chauffant, seringues et solution saline physiologique.
Instrument stéréotaxique pour petits animaux (SASI)	Thomas RECORDING GmbH	AN000287	Le modèle doit être choisi en fonction de l’animal (rat, cochon d’Inde, singes, etc.) utilisé dans l’étude
Caméra vidéo	EverFocus		EverFocus, modèle : EQ150