Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Solutions pour les enregistrements en tranches aiguës
- Préparer des solutions mères de 10 solutions de liquide céphalo-rachidien artificiel (124 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1 mM de NaH2PO4 et 11 mM de D-glucose) dans de l’eau pure désionisée avant les expériences d’électrophysiologie. Conserver la solution à 4 °C dans un flacon de 1 L sans CaCl2 et MgCl2.
- Préparez la solution de pipette à base de gluconate de potassium pour qu’elle contienne 135 mM de K-gluconate, 1,2 mM de KCl, 10 mM d’HEPES, 0,2 mM d’EGTA, 2 mM de MgCl2, 4 mM de MgATP, 0,4 mM de Tris-GTP, 10 mM de Na 2-phosphocréatine et 2,7 à 7,1 mM de biocytine pour la révélation post-hoc de la morphologie cellulaire. Ajustez le pH de la solution à 7,3 et l'osmolarité à 290 mOsm. Conserver 1 mL d’aliquotes à -20 °C.
2. Enregistrement par patch-clamp de cellules entières
- Transférez doucement une tranche de cerveau contenant le complexe de l’hippocampe à l’aide d’une pipette de transfert en verre sur mesure vers la chambre d’enregistrement montée sur un microscope vertical. Une pipette de transfert est constituée d’une pipette Pasteur raccourcie (diamètre intérieur de 6,5 mm) fixée à une poire de pipette en caoutchouc. Perfuser en continu la chambre d’enregistrement (3 mL) avec 34 °C (réchauffé) aCSF bouillonné avec 95 %/5 % O2/CO2. Réglez la vitesse de la pompe péristaltique à 2-3 mL/min.
- Examinez brièvement l’expression de Chronos-GFP dans les terminaisons axonales de la région d’intérêt avec un éclairage LED bleu (470 nm) et observez avec un objectif 4x. La fluorescence GFP est visualisée à travers un filtre d’émission approprié, avec une image de caméra CCD affichée sur un écran d’ordinateur.
- Placez une ancre de tranche faite d’un fil de platine en forme de U avec des cordes de nylon étroitement espacées (« harpe ») sur la tranche pour la maintenir.
- Passez à un objectif d’immersion 63x et ajustez la mise au point. Vérifiez la présence d’axones exprimant Chronos-GFP et choisissez un neurone pyramidal pour l’enregistrement par patch.
- Déplacez l’objectif vers le haut.
- Tirez les pipettes à l’aide d’un extracteur d’électrode Brown-Flaming en verre borosilicate. L’extracteur est configuré pour produire des pipettes d’environ 1 μm de diamètre de pointe. Remplissez les pipettes avec une solution interne à base de K-gluconate.
- Montez la pipette dans le support de pipette sur la tête. Abaissez la pipette dans la chambre et trouvez la pointe sous l’objectif. La résistance de la pipette doit être comprise entre 3 et 8 MΩ. Appliquez une légère pression positive à l’aide d’une seringue de manière à ce qu’un cône de solution sorte de la pipette et abaissez progressivement la pipette et l’objectif à la surface de la tranche.
- Patchez la cellule en configuration voltage-clamp : approchez-vous du neurone identifié et appuyez délicatement la pointe de la pipette sur le soma. La pression positive doit produire une fossette à la surface de la membrane. Relâchez la pression pour créer un joint giga-ohm (résistance >1 GΩ). Une fois scellé, réglez la tension de maintien à -65 mV. Cassez la membrane avec une forte impulsion de pression négative : cela est réalisé en appliquant une forte aspiration sur un tube relié au porte-pipette.
- Enregistrer en mode de pince de courant de cellule entière les réponses du neurone aux pas de courant hyperpolarisants et dépolarisants (Figure 1A).
note: Ce protocole sera utilisé pour déterminer les propriétés intrinsèques actives et passives de la cellule. Des routines MATLAB personnalisées sont utilisées pour l’analyse hors ligne.
- Enregistrer dans les réponses postsynaptiques à courant ou à tension clamp à la stimulation LED 475 nm en champ entier de fibres afférentes exprimant Chronos. Stimulez avec des trains de 10 stimulations d’une durée de 2 ms à 20 Hz (Figure 1 B, C). L’intensité lumineuse peut varier de 0,1 à 2 mW.
note: L’intensité lumineuse a été mesurée à l’aide d’une console d’alimentation optique numérique équipée d’un capteur à photodiode, positionnée sous l’objectif. Des latences de réponse de 2 à 4 ms sont caractéristiques d’une connexion monosynaptique.
