Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation du matériel et des logiciels pour les enregistrements multicanaux
- Configurez un système d’acquisition de données à 16 canaux selon les instructions du fabricant.
note: Plusieurs amplificateurs et systèmes d’acquisition de données disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour collecter des enregistrements multicanaux. Dans les expériences décrites ici, les signaux analogiques sont délivrés via un panneau de référence d’électrode à deux amplificateurs, où ils sont amplifiés (2000x) et filtrés (0,1-10 kHz). Les entrées analogiques du système d’acquisition de données sont numérisées à 40 kHz.
- Fixez l’adaptateur de platine de tête à 16 canaux approprié à un micromanipulateur de microscope. Orientez l’adaptateur de manière à ce que les ports du connecteur femelle soient orientés vers le bas.
- Ajustez l’angle de fonctionnement de ce micromanipulateur de manière à ce qu’il soit orienté vers le bas vers la chambre d’enregistrement à un angle d’environ 70° par rapport à l’horizontale.
- Connectez l’entrée de l’étage de tête à une sonde 16 x 1 pour l’électrophysiologie in vitro via l’adaptateur de l’étage de tête ancré au micromanipulateur.
- Connectez le connecteur de sortie de l’étage supérieur au système d’acquisition de données.
- Installez un logiciel approprié pour l’acquisition de données. Configurez 15 voies d’entrée pour correspondre aux signaux d’entrée des 15 premiers contacts de sonde multivoies. Configurez le canal restant pour recevoir l’entrée de l’électrode intracellulaire.
note: Lors de la collecte et de l’analyse des données, veillez à prendre en compte les cartes d’électrodes et d’adaptateurs pour vous assurer que le signal approprié correspond au contact de l’électrode à partir duquel il a été collecté.
2. Configuration des protocoles de stimulation lumineuse
- Mettez en place un système de distribution de lumière et installez le logiciel qui l’accompagne.
- Ouvrez le logiciel. Choisissez une configuration de câblage matériel dans laquelle une source de déclenchement (numérique/TTL (sortie logique transistor-transistor)) fournit un signal d’entrée de déclenchement au système de diffusion de lumière, et le système de distribution de lumière fournit un signal de sortie de déclenchement à une LED de 470 nm (diode électroluminescente).
- Monture d’objectif haute puissance. À l’aide d’un appareil photo numérique, calibrez les objectifs haute puissance avec le système de diffusion de lumière.
- Créez une nouvelle séquence de profils de stimulation lumineuse.
- Créez un motif de choix. Dans les expériences décrites ici, un cercle de diamètre 150 μm permet l’activation spécifique de la couche des terminaisons axonales.
- Pour construire une séquence de profils, copiez et collez ce profil pour chacun des essais.
- Créez une liste de formes d’onde contenant des formes d’onde de n’importe quelle intensité lumineuse, durée d’impulsion ou nombre d’impulsions.
- Attribuez des formes d’onde de manière aléatoire à chaque profil. Chaque profil avec sa forme d’onde attribuée correspond à une impulsion de déclenchement d’une entrée TTL numérique ou à un essai.
- Enregistrez la séquence de profils.
- Dans le logiciel d’acquisition de données, créez un nouveau protocole.
- Définissez le nombre d’essais pour qu’il soit égal au nombre de profils dans la séquence de profils créée.
- Choisissez des entrées de signal correspondant à celles configurées à l’étape 1.6. Configurez un protocole qui fournit une seule sortie TTL numérique, en enregistrant à partir de ces 16 canaux d’entrée pendant une durée appropriée avant et après le déclenchement numérique.
3. Placement d’une sonde multicanal dans une tranche de tissu cérébral ex vivo
- Des bulles perfusées d’eACSF (liquide céphalo-rachidien artificiel expérimental) (non dans des sacs scellés) à 3-6 mL/min.
- Transférez la tranche de cerveau contenant une zone d’intérêt sur la grille de maillage d’une chambre de perfusion de microscope. Ancre avec harpe en platine
- Faites pivoter la grille de maille de sorte que la ligne de contacts de l’électrode à l’extrémité distale de la sonde multicanaux soit approximativement perpendiculaire à la surface piale.
- Abaissez la sonde multicanaux vers la surface de la tranche sous un éclairage à large champ et un contrôle précis du micromanipulateur.
- Faites pivoter la tourelle du cube filtrant pour engager le cube de filtre approprié afin de visualiser la protéine rapporteure fluorescente exprimée dans les terminaisons axonales des afférences corticales. Si nécessaire, faites pivoter la tranche pour aligner plus précisément la sonde avec la surface piale.
- Positionnez la sonde juste au-dessus du plan de la tranche, à ~200 μm de la position finale de la cible le long de l’axe des x, en laissant au moins un canal à l’extérieur de la limite de la zone de tissu enregistrée.
- Insérez lentement la sonde dans la tranche en déplaçant le manipulateur le long de son axe longitudinal. Pour minimiser les dommages aux tissus, n’avancez la sonde que dans la mesure où les pointes pointues sont à peine visibles sous la surface du tissu. Cela minimisera les dommages aux tissus tout en garantissant que les contacts des électrodes sont en contact avec le tissu.
4. Patch clampant les neurones ciblés et obtenant une configuration de cellule entière
- Basculez la source eACSF vers la solution de contrôle avec sac.
- Identifiez les cellules marquées par fluorescence pour un enregistrement ciblé par patch clamp.
- Limitez l’ouverture du diaphragme à iris au plus petit diamètre. Engagez une lentille d’objectif de faible puissance et faites la mise au point sur le tissu.
- Centrez la lumière sur une zone de tissu adjacente (mais ne chevauchant pas) la sonde multicanaux.
- Engagez l’objectif d’immersion dans l’eau haute puissance (40x ou 60x), en faisant attention d’éviter tout contact entre la sonde multicanaux et la lentille de l’objectif.
- Tournez la tourelle du cube de filtre pour engager le jeu de filtres approprié afin de permettre l’imagerie des cellules exprimant le marqueur fluorescent dépendant de Cre.
- Identifiez une cellule marquée par fluorescence comme cible pour l’enregistrement par patch clamp. Soulevez l’objectif pour créer suffisamment d’espace pour abaisser une pipette patch.
- Chargez une pipette patch (voir tableau 1) avec la solution interne (tableau 2) et montez la pipette dans le porte-électrode. À l’aide d’une seringue de 1 ml, appliquez une pression positive correspondant à ~0,1 ml d’air.
- Abaissez la pipette patch dans la solution. Faites la mise au point sur la pointe de la pipette sous guidage visuel.
- Obtenez l’enregistrement de la cellule entière à partir de la cellule ciblée en suivant les étapes décrites précédemment33.
- Si vous prévoyez d’évaluer les changements apportés aux propriétés intrinsèques de la cellule (p. ex., résistance d’entrée, potentiel d’action, taux de décharge en réponse aux étapes actuelles), effectuez ces enregistrements. Sinon, passez au protocole de stimulation axonale ci-dessous.
Tableau 1 : Composition du liquide céphalo-rachidien artificiel et de la solution intracellulaire. Les réactifs et les concentrations pour l’eACSF et la solution de pipette intracellulaire pour les enregistrements par patch clamp sont répertoriés.
)
| Expérience ACSF, eACSF (en mM) |
| NaCl | N° 111 |
| NaHCO3 | 35 |
| HEPES | 20 |
| Kcl | 1.8 |
| CaCl2 | 2.1 |
| Magnésium (MgSO4 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 |
| glucose | 10 |
| Solution interne |
| K-gluconate | 140 |
| NaCl | 10 |
| HEPES | 10 |
| EGTA | 0,1 |
| MgATP | 4 |
| NaGTP | 0,3 |
| pH = 7,2 |
