Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparations préchirurgicales
- Préparation de la solution d’électrode
- Pour préparer la solution de remplissage de l’électrode, préparez une solution d’acétate de potassium 4 M avec 140 mM de chlorure de potassium.
- Préparation de l’électrode
- À l’aide de l’aspiration sous vide, insérez une fibre de carbone T-650 (7 μm de diamètre) dans un capillaire en verre borosilicaté (longueur = 100 mm, diamètre = 1,0 mm, diamètre intérieur = 0,5 mm).
- Une fois que la fibre de carbone a été placée à l’intérieur du capillaire en verre, placez le capillaire en verre dans un extracteur d’électrode vertical, avec l’élément chauffant à peu près au milieu du capillaire. Réglez le chauffage sur 55 avec l’aimant éteint.
- Une fois le capillaire tiré, soulevez avec précaution le support capillaire supérieur afin que la pointe de l’électrode ne soit pas entourée par l’élément chauffant.
- À l’aide de ciseaux tranchants, coupez la fibre de carbone qui relie encore les deux morceaux du capillaire. Cela se traduira par deux microélectrodes en fibre de carbone distinctes.
- Au microscope optique, coupez soigneusement la fibre de carbone exposée avec un scalpel bien aiguisé de manière à ce qu’elle s’étende d’environ 75 à 100 μm au-delà de l’extrémité du verre.
- À l’aide d’un microscope optique, assurez-vous que l’électrode est exempte de fissures le long du capillaire et que le joint d’étanchéité à la sortie de la fibre de carbone est difficile à remarquer et exempt de fissures.
note: Une bonne étanchéité aidera à réduire le bruit pendant les enregistrements.
- Fabrication d’électrodes de référence
- Soudez une broche dorée à un fil d’argent de 5 cm.
- Fixez l’anode à un trombone en métal ou à un autre conducteur, la cathode à une broche et appliquez une tension (~2 V) pendant que le trombone et le fil d’argent sont immergés dans 0,1 M HCl.
- Arrêtez la tension une fois qu’un revêtement blanc (AgCl) apparaît sur le fil d’argent.
- Préparation des électrodes pour l’implantation
- Soudez une broche dorée à un mince fil isolé (~10 cm de longueur, <0,50 mm de diamètre).
- Retirez ~5 cm d’isolant du fil opposé à la broche dorée.
- Remplissez l’électrode à moitié environ avec la solution d’électrode.
- Insérez le fil isolé dans l’électrode.
note: Le fil doit entrer en contact avec la fibre de carbone à l’intérieur de l’électrode.
2. Implantations d’électrodes
- Administrer à des rats Sprague Dawley adultes mâles (250 à 450 g) une injection intrapéritonéale (1,5 g/kg ou 1 mL/kg de volume) de 0,5 g/mL d’uréthane dissous dans une solution saline stérile. Commencez par une dose initiale d’uréthane de 1,0 à 1,2 g/kg. Si l’animal réagit toujours au test de stimulus nocif (pincement de la queue) 20 min après l’administration d’uréthane, administrer 0,3 à 0,5 g/kg d’uréthane supplémentaire pour une dose totale de 1,5 g/kg.
note: Pour préparer la solution d’uréthane à 0,5 g/mL, ajoutez 10 g d’uréthane à 10 g (~10 mL) de solution saline. L’uréthane est cancérigène et doit être manipulé avec soin. Cependant, il s’agit d’un anesthésique important, car il ne modifie pas les niveaux de dopamine, comme le font d’autres anesthésiques tels que la kétamine/xylazine et l’hydrate de chloral.
- Une fois que l’animal est profondément anesthésié et qu’il ne réagit pas aux stimuli nocifs (p. ex., pincement des orteils), placez-le dans le cadre stéréotaxique. Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur chaque œil du rat.
note: Il s’agit d’une chirurgie de non-survie, mais une bonne technique d’asepsie est encouragée.
- Nettoyez le cuir chevelu du rat à l'aide d'un gommage en deux étapes (c'est-à-dire un gommage à l'iodopovidone suivi d'un gommage à l'éthanol à 70 % ; effectuez une répétition en 3 cycles).
- Coupez le tissu du cuir chevelu à l’aide d’une pince à nez à aiguille stérilisée et de ciseaux chirurgicaux. Retirez une quantité importante de tissu pour faire de la place pour les différentes implantations décrites ci-dessous.
- Nettoyez délicatement la surface du crâne à l’aide d’applicateurs en coton stérilisé. Appliquez ensuite 2 à 3 gouttes de peroxyde d’hydrogène à 3 % pour aider à identifier le lambda et le bregma.
- À l’aide d’une perceuse stéréotaxique ou à main (1,0 mm, ~20 000 tr/min), percez un trou de 1,5 mm de diamètre, à 2,5 mm à l’avant du bregma et à 3,5 mm latéralement du bregma. Implantez partiellement (à peu près à mi-chemin, jusqu’à ce qu’il soit fermement en place) une vis (1,59 mm de diamètre extérieur, 3,2 mm de long) dans ce trou. Il est recommandé d’utiliser une solution saline stérile pour irriguer pendant le forage afin d’éviter les dommages thermiques.
- Pour l’électrode de référence, percez un trou de 1,0 mm de diamètre, 1,5 mm en avant et 3,5 mm latéralement par rapport au bregma, dans l’hémisphère gauche.
- À la main, insérez ~2 mm de fil de référence dans ce trou tout en enroulant le fil de référence autour et sous la tête de la vis implantée.
- Implantez complètement la vis, en fixant l’électrode de référence en place.
- Dans l’hémisphère droit, percez un trou de 1,5 mm de diamètre, 1,2 mm en avant et 1,4 mm latéralement par rapport au bregma.
- Retirez délicatement la dure-mère à l’aide d’une pince à épiler.
- Pour l’électrode de stimulation, percez un trou carré (2 mm avant-postérieur, 5 mm médial-latéral) centré à 5,2 mm en arrière et 1,0 mm latéralement au bregma.
- À l’aide des barres de bras stéréotaxiques, abaissez l’électrode/canule de guidage de stimulation bipolaire à 5 mm sous la dure-mère. En cas de saignement lors de l’implantation de l’électrode, utilisez des cotons-tiges stériles et de la gaze pour minimiser les saignements.
note: L’électrode de stimulation bipolaire utilisée dans cette méthode est prééquipée d’une canule de guidage (Table des matériaux). La canule interne utilisée avec cet article doit être rincée avec les broches de l’électrode de stimulation bipolaire lorsqu’elle est complètement insérée dans la canule de guidage. Cela permettra à la canule interne de se placer directement entre les deux broches du stimulateur, qui se trouvent à environ 1 mm l’une de l’autre. Un protocole similaire est décrit ailleurs.
- À l’aide des barres de bras stéréotaxiques, abaissez la microélectrode en fibre de carbone à 4 mm sous la dure-mère. Cet emplacement se trouve dans la partie la plus dorsale du striatum.
- Connectez le fil de référence et la fibre de carbone à un potentiostat.
- Appliquez une forme d’onde triangulaire (-0,4−1,3 V, 400 V/s) pendant 15 min à 60 Hz, puis à nouveau pendant 10 min à 10 Hz.
note: En règle générale, lors de l’application de formes d’onde à des microélectrodes en fibre de carbone dans le cerveau, des groupes d’oxyde sont ajoutés à la surface de la fibre de carbone. L’équilibre de cette réaction doit être atteint avant l’enregistrement ; Sinon, une dérive importante se produira19. Le cycle de l’électrode à des fréquences plus élevées (60 Hz) permet à la fibre de carbone d’atteindre l’équilibre plus rapidement.
3. Optimisation de la fibre de carbone et stimulation de l’emplacement des électrodes/canules guides
- Réglez le stimulateur pour qu’il produise une forme d’onde électrique bipolaire, avec une fréquence de 60 Hz, 24 impulsions, un courant de 300 μA et une largeur d’impulsion de 2 ms/phase.
- Abaissez doucement le stimulateur par incréments de 0,2 mm de 5 mm à 7,8 mm sous la dure-mère. À chaque incrément, stimulez le VTA.
note: À des profondeurs dorsales plus importantes (5 à 6 mm), la stimulation du cerveau provoquera généralement (~80 % du temps) des contractions des moustaches du rat. À des profondeurs plus importantes, les moustaches cesseront de se contracter, ce qui se produit entre 7,5 et 8,2 mm sous la dure-mère. Lorsque les moustaches cessent de se contracter, l’électrode de stimulation sera à proximité ou au niveau de l’ATV. Cela ne se produira pas chez tous les rats, et l’absence de contractions des moustaches ne doit pas être considérée comme un signe que l’électrode/canule de stimulation bipolaire / canule de perfusion est mal placée. Il se peut que les contractions des moustaches ne se produisent pas pour tous les anesthésiques (par exemple, l’isoflurane).
- Continuez à abaisser l’électrode de stimulation bipolaire/canule guide jusqu’à ce qu’une stimulation produise une libération de DA phasique au niveau de la microélectrode en fibre de carbone (actuellement dans le striatum dorsal).
note: La libération de DA dans le striatum dorsal ne se produira pas toujours si l’électrode bipolaire est implantée dans le VTA, mais l’observation de la libération de DA dans le striatum dorsal lors de la stimulation VTA est généralement un bon signe qu’un bon signal sera observé dans le noyau NAc.
- Abaissez la microélectrode en fibre de carbone jusqu’à ce qu’elle soit à au moins 6,0 mm en dessous de la dure-mère. C’est la partie la plus dorsale du noyau NAc.
- Stimulez le VTA et enregistrez l’amplitude de crête du pic DA.
- Abaissez ou relevez la microélectrode en fibre de carbone à l’endroit où l’on produit le plus grand dégagement de DA.
- Assurez-vous que le pic de réponse DA est un pic d’oxydation clair à 0,6 V et un pic de réduction à -0,2 V. Ces pics indiquent DA.
4. Enregistrement FSCV de perfusion et de stimulation
REMARQUE : La figure 1 montre la chronologie de l’enregistrement avant et après la micro-perfusion VTA.
- Une fois que l’emplacement de la fibre de carbone et de l’électrode/canule guide de stimulation a été optimisé, stimulez pendant ~20−30 min.
note: Selon les paramètres de stimulation actuels, ne stimulez pas plus d’une fois toutes les 3 minutes, pour permettre le rechargement vésiculaire22.
- Après avoir obtenu une base stable (variation de <20 % sur cinq stimulations), abaissez doucement la canule interne à la main dans la canule guide préinstallée dans le stimulateur bipolaire.
- Prenez 2 à 3 enregistrements de base supplémentaires pour vous assurer que l’insertion de la canule elle-même n’a pas modifié le signal évoqué. Dans certains cas, l’insertion et le retrait de la canule interne peuvent endommager l’ATV. Si le signal change radicalement au cours de cette période de référence (>20 %), prenez 3 à 4 enregistrements supplémentaires jusqu’à ce que la ligne de base se stabilise.
- À l’aide d’un pousse-seringue et d’une micro-seringue, injecter 0,5 μL de solution (p. ex. solution saline à 0,9 %, N-méthyl-D-aspartate [NMDA], acide (2R)-amino-5-phosphonovalérique [AP5]) dans l’ATV sur une période de 2 minutes.
- Après la perfusion, laissez la canule interne pendant au moins 1 minute avant de la retirer.
note: Certains médicaments peuvent nécessiter de quitter la canule interne pendant une période plus longue en fonction de la cinétique du médicament, et le retrait de la canule interne peut faire remonter le médicament à travers la canule interne. En cas d’inquiétude, on peut laisser la canule interne dans la canule guide pendant toute la durée de l’enregistrement. Sinon, l’enregistrement peut commencer après cet intervalle de 1 minute.
- Poursuivez l’enregistrement toutes les 3 minutes pour mesurer les effets post-infusion.
note: Si l’on perfuse une solution témoin, et qu’aucun effet n’est observé, il est possible d’infuser une seconde fois10. S’il y a une altération de la libération de DA causée par l’insertion de la canule interne ou de la perfusion saline, le signal revient généralement à la ligne de base dans les 30 minutes.
