Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Scellement de cellule pour l’enregistrement
- Assurez-vous que tous les équipements (microscope, amplificateur, numériseur, micromanipulateur et autres) sont allumés avant de commencer l’enregistrement.
- Remplissez la chambre d’enregistrement, d’une marque commerciale (Table of Materials), fixez-la au microscope avec la solution aCSF pour les enregistrements. À l’aide d’une pompe de perfusion, perfuser constamment le LCR à un débit de 2 mL/min.
- Transférez une tranche de cerveau d’intérêt (une à la fois) dans la chambre d’enregistrement. À l’aide d’une pipette de transfert en acrylique (pipette en verre Pasteur inversé fixée à une tétine en silicone), transférez les tranches hypothalamiques dans la chambre. Utilisez une ancre de tranche (Table des matériaux) pour maintenir la tranche afin qu’elle ne bouge pas pendant la perfusion de l’aCSF.
- Placez une tranche au centre de la chambre d’enregistrement fixée au microscope. La position de la coupe est essentielle pour permettre une bonne vision de la région souhaitée au microscope et pour une portée parfaite de la micropipette enregistreuse.
- Utilisez l'objectif basse consommation d'un microscope à immersion (10x ou 20x) pour aider à positionner la tranche et à localiser la région d'intérêt.
- Après avoir localisé la région d’intérêt, basculez la lentille de l’objectif sur la lentille haute puissance (63x) et concentrez-vous sur le niveau tissulaire, en observant la protéine fluorescente endogène et les formes des cellules de la région cible pour localiser les cellules kisspeptine à la surface de la tranche de cerveau.
- Lorsqu’une cellule cible possible est localisée, marquez-la sur l’écran de l’ordinateur avec le curseur de la souris ou en dessinant un format, comme un carré, sur la zone d’intérêt. La marque d'écran de l'ordinateur permet de guider la position de la micropipette d'enregistrement vers la cellule.
- Après avoir déterminé l’emplacement exact de la cellule cible, soulevez l’objectif et introduisez la micropipette enregistreuse remplie de la solution interne. Lorsque vous placez la micropipette dans le porte-électrode, assurez-vous que la solution interne est en contact avec l’électrode d’argent.
note: Pour la préparation, le placement et le positionnement des micropipettes sur le porte-électrode.
- Appliquez une pression positive avant d’immerger la micropipette dans la solution de LCRa, pour empêcher les débris de pénétrer dans la micropipette, à l’aide d’une seringue remplie d’air de 1 à 3 ml reliée au porte-micropipette par un tube en polyéthylène (≈130 cm plus long) ; appliquez près de 100 à 200 μL d’air.
- À l’aide du micromanipulateur, guidez la micropipette sous le centre de l’objectif. Déplacez les boutons du micromanipulateur pour guider la micropipette sur l’axe X-Y-Z vers la cellule d’intérêt.
- Ajustez la mise au point pour voir la pointe de la micropipette et rapprochez-la, mais pas trop, de la tranche. Réduisez la vitesse du micromanipulateur et abaissez lentement la micropipette dans le plan de mise au point. Assurez-vous que la pointe de la micropipette ne pénètre pas brusquement dans la tranche, mais descend lentement jusqu’à ce qu’elle touche la surface de la cellule/région cible.
- Appliquez une légère pression positive (≈100 μL) avec la seringue remplie d’air de 1 à 3 ml fixée au porte-micropipette pour éliminer tout débris de la trajectoire d’approche.
- Concentrez-vous sur la cellule cible et déplacez lentement le micromanipulateur sur l’axe X-Y-Z pour rapprocher la micropipette de celle-ci. Lorsque vous touchez la micropipette à la cellule, une fossette causée par la pression appliquée à travers la pointe de la micropipette sera observée (Figure 2C).
- Après avoir formé la fossette, en raison de la proximité de la micropipette avec la cellule, appliquer une aspiration faible et brève par la bouche (1-2 s) à travers le tube relié au support de la micropipette pour générer l'étanchéité entre la micropipette et la cellule (joint gigaohm ou gigaseal >1 GΩ ; Figure 2D). Pour former le joint, utilisez le mode de tension clamp sur le logiciel.
- Si le joint reste stable (le joint en gigaohm doit être mécaniquement stable et sans interférence sonore, déterminée par l’observation pendant environ 1 min), réglez la tension de maintien au potentiel de repos physiologique le plus proche de la cellule d’intérêt. Pour les neurones hypothalamiques de kisspeptine, -50 mV est recommandé.
- Appliquer une brève aspiration buccale (pression négative) avec la micropipette scellée sur la cellule pour briser la membrane plasmique (Figure 2E). Une configuration adéquate de l’ensemble de la cellule est obtenue lorsque l’aspiration est effectuée avec une force suffisante pour que la membrane rompue n’obstrue pas la micropipette et n’attire pas une partie importante de la membrane ou même de la cellule.
- Vérifiez le manuel des paramètres système utilisé. À l’aide du logiciel (voir la table des matériaux), vous pouvez vérifier et calculer numériquement la résistance série (SR) et la capacité de la cellule entière (WCC).
- En mode pince de tension, après avoir brisé la membrane de la cellule, activez l’option de cellule entière et cliquez sur la commande Auto en faisant référence à l’onglet de la cellule entière. Le SR et le wcc de la cellule seront automatiquement calculés et affichés instantanément par le logiciel. Ces paramètres peuvent également être vérifiés en effectuant le test de membrane avec l’amplificateur mentionné dans le Tableau des matériaux.
- Assurez-vous de vérifier les paramètres de viabilité des cellules. Pour les neurones kisspeptine, vérifiez que les mesures électrophysiologiques sont : SR < 25 mΩ, résistance d’entrée > 0,3 GΩ et maintien de la valeur absolue du courant < 30 pA. La valeur moyenne du WCC des neurones AVPV/PeNKisspeptine ou ARHkisspeptine est ≈ 10-12 pF chez les souris gonades intactes.
- Surveiller le RS et la capacité à l’état d’équilibre de la cellule pendant les expériences. Assurez-vous que le SR ne change pas de plus de 20 % pendant un enregistrement et que la capacité de la membrane est stable.
- Vérifiez les paramètres du logiciel. Créez des protocoles spécifiques pour les enregistrements en fonction du type d’expérience. Pour enregistrer le potentiel membranaire en mode pince de courant, avec l’équipement mentionné dans la Table des matériaux, filtrez passe-bas les signaux électrophysiologiques à 2-4 kHz et analysez les résultats hors ligne dans le logiciel (voir la Table des matériaux pour plus d’informations sur le logiciel).
- Une fois que la configuration de la cellule entière est correctement réalisée, mesurez les courants synaptiques en mode pince de tension (Figure 2G). Enregistrer les variations du potentiel de membrane au repos (RMP) et les variations RMP induites en mode de pince de courant (Figure 2H). Des modifications de la RMP, telles que la dépolarisation de la membrane cellulaire, peuvent être induites par l’administration d’un médicament/neurotransmetteur connu dans le bain (décrit à l’étape 1.2), comme illustré à la Figure 1.
note: En mode ampèremètre, un courant positif ou négatif peut être injecté pour maintenir la tension de la membrane à la tension souhaitée. Pour les neurones kisspeptine, nous définissons généralement une injection de courant nulle (I = 0) pour enregistrer la variation spontanée du potentiel membranaire.
