Évaluation des réseaux neuronaux à l’aide d’un réseau de microélectrodes dans des coupes de moelle épinière de souris

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Électrophysiologie in vitro

1. Préparation de solutions pour la préparation et l’enregistrement des coupes de moelle épinière
   1. Liquide céphalo-rachidien artificiel
      note: Le liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa) est utilisé dans une chambre d’incubation d’interface, où les tranches sont stockées jusqu’au début de l’enregistrement et pendant les expériences comme perfusat et diluant pour les médicaments. Voir le tableau 1 pour la composition détaillée.
2. Préparez un LCR contenant (en mM) du 118 NaCl, du 25 NaHCO₃, du 10 glucose, du 2,5 KCl, du 1 NaH₂PO₄, du 1 MgCl₂ et du 2,5 CaCl₂ en ajoutant les quantités requises de ce qui précède, à l’exclusion du CaCl₂, à 2 L d’eau distillée.
3. Faites buller la solution ci-dessus avec du carbogène (95 % O₂, 5 % CO₂) pendant 5 min et ajoutez CaCl₂.
   note: Cette étape empêche les précipitations de CaCl₂, c’est-à-dire que la solution ne doit pas devenir trouble. Pour l’application de médicaments pendant les expériences, diluer les solutions mères de médicament dans un LCR jusqu’aux concentrations finales souhaitées.

2. Liquide céphalo-rachidien artificiel substitué par du saccharose

REMARQUE : Le LCRa substitué au saccharose est utilisé lors de la dissection et du tranchage de la moelle épinière. Comme son nom l’indique, le saccharose est substitué au NaCl pour réduire l’excitation neuronale pendant ces procédures tout en maintenant l’osmolarité. Voir le tableau 1 pour la composition détaillée.

1. Préparez un LCa substitué par du saccharose contenant (en mM) 250 saccharose, 25 NaHCO₃, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ et 2,5 CaCl₂ en ajoutant les quantités requises de tous les éléments ci-dessus, à l’exclusion du CaCl₂, à 300 mL d’eau distillée.
2. Faites buliser la solution avec du carbogen pendant 5 min puis ajoutez du CaCl₂.
3. Conservez la solution dans un congélateur à -80 °C pendant environ 40 minutes ou jusqu’à ce que la solution forme une boue. Évitez de geler les solides et utilisez-les dans la consistance d’une boue.

3. Préparation du réseau de microélectrodes

REMARQUE : La surface de contact du MEA nécessite un prétraitement pour la rendre hydrophile.

1. Avant l’expérience, remplissez bien le MEA avec du sérum fœtal bovin (FBS) ou du sérum de cheval (HS) pendant 30 min.
2. Retirez le FBS ou le HS et rincez abondamment le MEA avec environ cinq lavages d’eau distillée jusqu’à ce que l’eau distillée ne soit plus mousseuse. Remplissez le puits avec de l’aCSF, prêt à l’emploi.

4. Préparation de la coupe aiguë de la moelle épinière

1. Anesthésier profondément la souris avec 100 mg/kg de kétamine (i.p.), puis la décapiter à l’aide de grands ciseaux chirurgicaux.
2. Retirez la peau sur la région abdominale en faisant une petite incision dans la peau au niveau des hanches. Tirez sur la peau de chaque côté de la rostrale coupée jusqu’à ce que toute la peau soit enlevée, c’est-à-dire du haut de la cage thoracique vers le haut du bassin (ventralement et dorsalement).
3. Placez le corps sur de la glace et utilisez une approche ventrale pour exposer la colonne vertébrale en enlevant tous les viscères et en coupant les côtes latéralement au sternum.
4. Retirez la cage thoracique ventrale, les deux omoplates (coupées à environ T2), les membres inférieurs et le bassin (coupés à peu près au sommet du sacrum).
5. Transférez la colonne vertébrale et la préparation des côtes dans un bain de dissection contenant du saccharose aCSF glacé. Épinglez les quatre coins de la préparation (surface ventrale vers le haut) en plaçant des épingles à travers les muscles du bas du dos et les côtes supérieures attachées.
6. Retirez tous les muscles et le tissu conjonctif recouvrant la surface ventrale des vertèbres avec des rongeurs et identifiez la région vertébrale au-dessus de l’élargissement lombo-sacré, qui se trouve approximativement sous les corps vertébraux T12 à L2.
7. Retirez un corps vertébral qui est caudal à la région d’élargissement lombo-sacré pour permettre l’accès à la moelle épinière lorsqu’elle se trouve dans le canal vertébral.
8. À l’aide de ciseaux à ressort incurvés, coupez les pédicules vertébraux bilatéralement tout en soulevant et en tirant le corps vertébral de manière rostrale pour séparer les aspects ventral et dorsal des vertèbres et exposer la moelle épinière.
9. Une fois que les corps vertébraux sont retirés pour révéler l’élargissement lombo-sacré, dégagez soigneusement les racines restantes qui ancrent la moelle épinière avec des ciseaux à ressort jusqu’à ce que le cordon flotte librement.
10. Isolez la moelle épinière avec des coupures rostrales et caudales bien au-dessus et en dessous de l'élargissement lombo-sacré, permettant à la région cible de la moelle de « flotter librement ».
    note: L’orientation préférée de la tranche déterminera la façon dont le cordon est ensuite monté pour le sectionnement (Figure 1).
11. Pour les tranches transversales, soulevez le segment lombo-sacré par une racine attachée et placez-le sur un bloc de polystyrène (polystyrène) prédécoupé (1 cm x 1 cm x 1 cm) avec un canal peu profond coupé au centre. À l’aide d’un adhésif cyanoacrylate (voir le tableau des matériaux), fixez le bloc et le cordon à la plate-forme de sectionnement et placez-le dans le bain de coupe contenant du saccharose aLCF (boue) glacé.
    note: Le canal peu profond aide à sécuriser et à orienter la moelle épinière, avec la face dorsale exposée et l’extrémité thoracique de la moelle au bas du bloc.
12. Pour les tranches sagittales, posez une fine ligne d’adhésif cyanoacrylate sur la plate-forme de sectionnement, soulevez l’élargissement lombo-sacré d’une racine attachée et placez le cordon le long de la ligne de colle, en vous assurant qu’une surface latérale est dans l’adhésif et que l’autre est tournée vers le haut. Placez-le dans le bain de coupe contenant du saccharose aCSF (boue) glacé.
13. Pour les tranches horizontales, placez une fine ligne de colle cyanoacrylate sur la plate-forme de sectionnement. Soulevez l’élargissement lombo-sacré par une racine attachée et placez l’élargissement lombo-sacré le long de la ligne d’adhésif, en vous assurant que la surface ventrale est dans l’adhésif et que la surface dorsale est tournée vers le haut. Utilisez les racines attachées pour positionner le cordon. Placez-le dans le bain de coupe contenant du saccharose aCSF (boue) glacé.

5. Enregistrements de réseaux de microélectrodes

REMARQUE : Les étapes suivantes expliquent comment utiliser les données d’enregistrement d’expériences basées sur l’AEM sur des coupes de moelle épinière. Plusieurs modèles MEA peuvent être utilisés en fonction de l’expérience. Les détails de conception des AEM utilisés dans ces expériences sont présentés dans le tableau 2 et la figure 2. Des informations de conception détaillées ont été publiées par Egert et al. et Thiebaud et al. pour les AEM planaires et tridimensionnels (3D), respectivement. Les deux types MEA sont composés de 60 électrodes en nitrure de titane, avec une couche isolante en nitrure de silicium et des pistes et des coussinets de contact en nitrure de titane.

1. Dispositif expérimental
   1. Allumez l’ordinateur et la carte d’interface, puis démarrez le logiciel d’enregistrement.
   2. Chargez le modèle d’enregistrement préassemblé (Figure 3A). Nommez les fichiers de la journée dans l’onglet de l’enregistreur.
   3. Bulle continue aCSF avec du carbogène (5 % CO₂, 95 % O₂) pendant la durée de l’expérience.
   4. Allumez le système de perfusion, qui est contrôlé par une pompe péristaltique. Placez la conduite d’entrée dans un LCR et l’extrémité d’entrée dans un bécher à déchets. Amorcez les lignes de perfusion avec un LCR.
   5. Préparer le 4-AP et toute autre solution médicamenteuse en diluant les souches dans 50 mL de LCRa jusqu’à la concentration finale requise (p. ex., 200 μM pour le 4-AP).
2. Activité de la 4-aminopyridine (4-AP)
   1. Après l’incubation, transférez une seule tranche de l’incubateur à l’aide d’une pipette Pasteur à grande pointe remplie d’aLCR.
   2. Placez la tranche dans le puits MEA et ajoutez de l’aCSF supplémentaire.
   3. Placez la tranche sur le réseau d’enregistrement à 60 électrodes à l’aide d’un pinceau fin à poils courts. Évitez d’entrer en contact avec les électrodes avec le pinceau ou de faire glisser le tissu sur les électrodes, surtout si vous utilisez des réseaux 3D.
      note: Selon la disposition de la MEA, cela peut être fait avec ou sans l’aide d’un microscope pour un positionnement précis.
   4. Après avoir positionné la tranche, placez un filet lesté sur le tissu pour le maintenir en place et favoriser un bon contact avec les électrodes MEA.
      note: La tranche peut avoir besoin d’être repositionnée après la mise en place du filet.
   5. Placez le MEA dans la tête d’écoute de l’enregistrement (Figure 2A, B).
   6. Vérifiez la position du tissu sur les électrodes à l’aide d’un microscope inversé (grossissement 2x) pour confirmer que le plus grand nombre possible d’électrodes se trouvent sous la corne dorsale superficielle (SDH). Assurez-vous qu’au moins 2 à 6 électrodes n’entrent pas en contact avec la tranche, car ces électrodes sont importantes pour soustraire le bruit et enregistrer les artefacts pendant l’analyse (Figure 2E).
   7. Allumez l’appareil photo, connectez-le à l’appareil et prenez une image de référence de la tranche par rapport à la MEA pour l’utiliser pendant l’analyse.
   8. Appuyez sur Start DAQ (acquisition de données) dans le logiciel d’enregistrement et confirmez que toutes les électrodes reçoivent un signal clair.
      note: Si le signal est bruyant, déclipsez la scène et nettoyez les pastilles de contact MEA et les contacts à ressort doré avec de l’éthanol à 70 % (utilisez une lingette de laboratoire pour vous assurer que les pastilles et les contacts sont secs après le nettoyage). Si le signal est toujours bruyant, éteignez les électrodes défectueuses dans le logiciel d’enregistrement ou notez-le pour exclusion plus tard pendant l’analyse.
   9. Fixez les conduites d’entrée et de sortie de perfusion au puits MEA (préalablement rempli d’aCSF) et allumez le système de perfusion. Vérifiez le débit, idéalement de 4 à 6 volumes de bain par minute, et assurez-vous que le débit sortant est suffisant pour éviter le débordement du superfusat.
   10. Laissez le tissu s’équilibrer pendant 5 minutes, puis enregistrez 5 minutes de données de base brutes et non filtrées.
   11. Déplacez la ligne d’entrée de perfusion du LCR aC vers une solution 4-AP et attendez 12 min pour que l’activité rythmique induite par 4-AP atteigne l’état d’équilibre (2 min pour que les médicaments atteignent le bain et 10 min pour que l’activité atteigne son pic puis se stabilise).
   12. Enregistrez 5 min d’activité induite par le 4-AP. Soyez prêt pour les enregistrements ultérieurs afin de tester les médicaments ou de vérifier la stabilité du 4-AP.

Tableau 1 : Compositions de liquide céphalo-rachidien artificiel.

Tableau 2 : Dispositions des réseaux de microélectrodes.

Figure 1 : Orientations, méthodes de montage et de coupe des coupes de la moelle épinière. (A) Les tranches transversales nécessitent un bloc de coupe en polystyrène avec une rainure de support découpée dedans. La moelle épinière est reposée contre le bloc dans la rainure de soutien, la face dorsale du cordon faisant face à l’opposé du bloc. Le bloc et le cordon sont collés sur une platine de coupe avec de la colle cyanoacrylate. (B) Les tranches sagittales sont préparées en plaçant une fine ligne d’adhésif cyanoacrylate sur l’étape de coupe, puis en positionnant la moelle épinière sur son côté sur la colle. (C) Les tranches horizontales sont préparées en plaçant une fine ligne d’adhésif cyanoacrylate sur l’étape de coupe, puis en positionnant la moelle épinière côté ventrale vers le bas sur la colle.

Figure 2 : Positionnement des tissus sur le réseau de microélectrodes. (A) L’image montre un étage de MEA ouvert avec un MEA placé en position. (B) Identique à A avec le statu quo de la MEA fermé pour les enregistrements et le système de perfusion tissulaire en place. (C) L’image montre un MEA tel que fourni par le fabricant. Les coussinets de contact, qui s’interfacent avec les ressorts dorés de la tête, et le bain de tissus MEA qui contient la solution de bain de tissus et la tranche de tissu sont présentés. La zone mise en évidence par le carré rouge au centre est l’emplacement du réseau d’électrodes. (D) Les schémas montrent les deux configurations d’électrodes MEA utilisées dans cette étude, avec plus de détails présentés dans le tableau 2. L’électrode de référence est désignée par le trapèze bleu. La disposition des électrodes MEA de gauche montre une configuration carrée à 60 électrodes, utilisée le plus souvent dans les modèles de travail présentés : 60MEA200/30iR-Ti avec des électrodes de 30 μm de diamètre espacées de 200 μm, ou des MEA 3 dimensionnels espacés de 200 μm et espacés de 100 μm (60MEA200/12/50iR-Ti et 60MEA100/12/40iR-Ti) avec des électrodes de 12 μm de diamètre et de 50 μm ou 40 μm de haut, respectivement. La disposition gauche des électrodes MEA montre une disposition rectangulaire de 6 x 10 électrodes - 60MEA500/30iR-Ti. (E) Image à fort grossissement d’un MEA carré 60MEA100/12/40iR-Ti avec une coupe transversale de la moelle épinière positionnée pour l’enregistrement. La tranche se trouve sur les rangées d’électrodes 3 à 8. La rangée supérieure d’électrodes, qui n’entrent en contact avec aucun tissu, sert d’électrodes de référence. La zone SDH apparaît sous la forme d’une bande semi-transparente. Dans ce cas, le SDH recouvre les électrodes des rangées 4, 5 et 6 et des colonnes 2, 3, 4, 5 et 7 de la MEA. Barre d’échelle = 200 μm. Abréviations : MEA = réseau de microélectrodes ; SDH = corne dorsale superficielle.

Figure 3 : Dispositions d’outils d’enregistrement et d’analyse de données et exemples d’enregistrements de réseaux de microélectrodes montrant le potentiel d’action extracellulaire et les formes d’onde de potentiel de champ local. (A) Le schéma montre un modèle d’enregistrement préconfiguré utilisé pour l’acquisition de données MEA. La liaison du MEA2100 et de l’outil d’enregistrement (étage/amplificateur) permet de nommer et de sauvegarder les données. Quatre exemples de traces de données brutes (à droite, époques de 5 minutes) ont été collectées par un canal MEA montrant l’activité au départ, 12 minutes après l’application de 4-AP, 15 minutes supplémentaires après l’activité 4-AP établie, et après l’application en bain de TTX (1 μM). Notez que l’ajout de 4-AP (deuxième trace) produit une nette augmentation du bruit de fond et de l’activité EAP/LFP. Il est important de noter que l’activité reste relativement stable pendant au moins 15 minutes après l’établissement de l’activité induite par le 4-AP (troisième trace). L’ajout de TTX (1 μM) abolit toute activité (trace de fond). (B) Le schéma (à gauche) montre la configuration du logiciel de l’analyseur pour l’analyse des données. L’outil d’exploration de données brutes est utilisé pour importer les enregistrements collectés par un logiciel d’enregistrement. Ces données sont ensuite passées par un outil de filtrage multicanal qui soustrait le(s) signal(s) de l’électrode de référence sélectionnée(s) des autres électrodes pour éliminer le bruit de fond. Les données passent par le filtre EAP et les outils de filtrage LFP pour optimiser les relations signal/bruit pour chaque forme d’onde. Après cette étape, les données du chemin EAP entrent dans l’outil de détection EAP, où les seuils sont définis. Les EAP sont détectés puis envoyés à l’outil d’analyse EAP où les latences de chaque événement sont enregistrées et exportées sous forme de txt. lime. Un flux de travail identique se produit pour les données LFP à l’aide d’une boîte à outils LFP correspondante. Les traces de droite montrent les données d’un seul canal MEA contenant diverses formes d’onde extracellulaires. L'emplacement des signaux EAP et LFP est mis en évidence dans les « rasters de comptage » ci-dessus. Les traces inférieures sont des époques de l'enregistrement supérieur (indiquées par des barres rouges) montrant des formes d'onde sur une échelle de temps étendue, y compris divers signaux LFP (notez la variété des apparences) et des EAP extracellulaires individuels (cercles rouges). Notez que la forme d’onde et la polarité LFP/EAP varient en fonction du nombre de neurones produisant ces signaux, de leur proximité avec l’électrode d’enregistrement et de leur emplacement par rapport à l’électrode ou aux électrodes proches. Abréviations : MEA = réseau de microélectrodes ; EAP = potentiel d’action extracellulaire ; LFP = potentiel de champ local ; 4-AP = 4-aminopyridine ; TTX = tétrodotoxine.