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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Électrophysiologie in vitro
- Préparation de solutions pour la préparation et l’enregistrement des coupes de moelle épinière
- Liquide céphalo-rachidien artificiel
note: Le liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa) est utilisé dans une chambre d’incubation d’interface, où les tranches sont stockées jusqu’au début de l’enregistrement et pendant les expériences comme perfusat et diluant pour les médicaments. Voir le tableau 1 pour la composition détaillée.
- Préparez un LCR contenant (en mM) du 118 NaCl, du 25 NaHCO3, du 10 glucose, du 2,5 KCl, du 1 NaH2PO4, du 1 MgCl2 et du 2,5 CaCl2 en ajoutant les quantités requises de ce qui précède, à l’exclusion du CaCl2, à 2 L d’eau distillée.
- Faites buller la solution ci-dessus avec du carbogène (95 % O2, 5 % CO2) pendant 5 min et ajoutez CaCl2.
note: Cette étape empêche les précipitations de CaCl2, c’est-à-dire que la solution ne doit pas devenir trouble. Pour l’application de médicaments pendant les expériences, diluer les solutions mères de médicament dans un LCR jusqu’aux concentrations finales souhaitées.
2. Liquide céphalo-rachidien artificiel substitué par du saccharose
REMARQUE : Le LCRa substitué au saccharose est utilisé lors de la dissection et du tranchage de la moelle épinière. Comme son nom l’indique, le saccharose est substitué au NaCl pour réduire l’excitation neuronale pendant ces procédures tout en maintenant l’osmolarité. Voir le tableau 1 pour la composition détaillée.
- Préparez un LCa substitué par du saccharose contenant (en mM) 250 saccharose, 25 NaHCO3, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 et 2,5 CaCl2 en ajoutant les quantités requises de tous les éléments ci-dessus, à l’exclusion du CaCl2, à 300 mL d’eau distillée.
- Faites buliser la solution avec du carbogen pendant 5 min puis ajoutez du CaCl2.
- Conservez la solution dans un congélateur à -80 °C pendant environ 40 minutes ou jusqu’à ce que la solution forme une boue. Évitez de geler les solides et utilisez-les dans la consistance d’une boue.
3. Préparation du réseau de microélectrodes
REMARQUE : La surface de contact du MEA nécessite un prétraitement pour la rendre hydrophile.
- Avant l’expérience, remplissez bien le MEA avec du sérum fœtal bovin (FBS) ou du sérum de cheval (HS) pendant 30 min.
- Retirez le FBS ou le HS et rincez abondamment le MEA avec environ cinq lavages d’eau distillée jusqu’à ce que l’eau distillée ne soit plus mousseuse. Remplissez le puits avec de l’aCSF, prêt à l’emploi.
4. Préparation de la coupe aiguë de la moelle épinière
- Anesthésier profondément la souris avec 100 mg/kg de kétamine (i.p.), puis la décapiter à l’aide de grands ciseaux chirurgicaux.
- Retirez la peau sur la région abdominale en faisant une petite incision dans la peau au niveau des hanches. Tirez sur la peau de chaque côté de la rostrale coupée jusqu’à ce que toute la peau soit enlevée, c’est-à-dire du haut de la cage thoracique vers le haut du bassin (ventralement et dorsalement).
- Placez le corps sur de la glace et utilisez une approche ventrale pour exposer la colonne vertébrale en enlevant tous les viscères et en coupant les côtes latéralement au sternum.
- Retirez la cage thoracique ventrale, les deux omoplates (coupées à environ T2), les membres inférieurs et le bassin (coupés à peu près au sommet du sacrum).
- Transférez la colonne vertébrale et la préparation des côtes dans un bain de dissection contenant du saccharose aCSF glacé. Épinglez les quatre coins de la préparation (surface ventrale vers le haut) en plaçant des épingles à travers les muscles du bas du dos et les côtes supérieures attachées.
- Retirez tous les muscles et le tissu conjonctif recouvrant la surface ventrale des vertèbres avec des rongeurs et identifiez la région vertébrale au-dessus de l’élargissement lombo-sacré, qui se trouve approximativement sous les corps vertébraux T12 à L2.
- Retirez un corps vertébral qui est caudal à la région d’élargissement lombo-sacré pour permettre l’accès à la moelle épinière lorsqu’elle se trouve dans le canal vertébral.
- À l’aide de ciseaux à ressort incurvés, coupez les pédicules vertébraux bilatéralement tout en soulevant et en tirant le corps vertébral de manière rostrale pour séparer les aspects ventral et dorsal des vertèbres et exposer la moelle épinière.
- Une fois que les corps vertébraux sont retirés pour révéler l’élargissement lombo-sacré, dégagez soigneusement les racines restantes qui ancrent la moelle épinière avec des ciseaux à ressort jusqu’à ce que le cordon flotte librement.
- Isolez la moelle épinière avec des coupures rostrales et caudales bien au-dessus et en dessous de l'élargissement lombo-sacré, permettant à la région cible de la moelle de « flotter librement ».
note: L’orientation préférée de la tranche déterminera la façon dont le cordon est ensuite monté pour le sectionnement (Figure 1).
- Pour les tranches transversales, soulevez le segment lombo-sacré par une racine attachée et placez-le sur un bloc de polystyrène (polystyrène) prédécoupé (1 cm x 1 cm x 1 cm) avec un canal peu profond coupé au centre. À l’aide d’un adhésif cyanoacrylate (voir le tableau des matériaux), fixez le bloc et le cordon à la plate-forme de sectionnement et placez-le dans le bain de coupe contenant du saccharose aLCF (boue) glacé.
note: Le canal peu profond aide à sécuriser et à orienter la moelle épinière, avec la face dorsale exposée et l’extrémité thoracique de la moelle au bas du bloc.
- Pour les tranches sagittales, posez une fine ligne d’adhésif cyanoacrylate sur la plate-forme de sectionnement, soulevez l’élargissement lombo-sacré d’une racine attachée et placez le cordon le long de la ligne de colle, en vous assurant qu’une surface latérale est dans l’adhésif et que l’autre est tournée vers le haut. Placez-le dans le bain de coupe contenant du saccharose aCSF (boue) glacé.
- Pour les tranches horizontales, placez une fine ligne de colle cyanoacrylate sur la plate-forme de sectionnement. Soulevez l’élargissement lombo-sacré par une racine attachée et placez l’élargissement lombo-sacré le long de la ligne d’adhésif, en vous assurant que la surface ventrale est dans l’adhésif et que la surface dorsale est tournée vers le haut. Utilisez les racines attachées pour positionner le cordon. Placez-le dans le bain de coupe contenant du saccharose aCSF (boue) glacé.
5. Enregistrements de réseaux de microélectrodes
REMARQUE : Les étapes suivantes expliquent comment utiliser les données d’enregistrement d’expériences basées sur l’AEM sur des coupes de moelle épinière. Plusieurs modèles MEA peuvent être utilisés en fonction de l’expérience. Les détails de conception des AEM utilisés dans ces expériences sont présentés dans le tableau 2 et la figure 2. Des informations de conception détaillées ont été publiées par Egert et al. et Thiebaud et al. pour les AEM planaires et tridimensionnels (3D), respectivement. Les deux types MEA sont composés de 60 électrodes en nitrure de titane, avec une couche isolante en nitrure de silicium et des pistes et des coussinets de contact en nitrure de titane.
- Dispositif expérimental
- Allumez l’ordinateur et la carte d’interface, puis démarrez le logiciel d’enregistrement.
- Chargez le modèle d’enregistrement préassemblé (Figure 3A). Nommez les fichiers de la journée dans l’onglet de l’enregistreur.
- Bulle continue aCSF avec du carbogène (5 % CO2, 95 % O2) pendant la durée de l’expérience.
- Allumez le système de perfusion, qui est contrôlé par une pompe péristaltique. Placez la conduite d’entrée dans un LCR et l’extrémité d’entrée dans un bécher à déchets. Amorcez les lignes de perfusion avec un LCR.
- Préparer le 4-AP et toute autre solution médicamenteuse en diluant les souches dans 50 mL de LCRa jusqu’à la concentration finale requise (p. ex., 200 μM pour le 4-AP).
- Activité de la 4-aminopyridine (4-AP)
- Après l’incubation, transférez une seule tranche de l’incubateur à l’aide d’une pipette Pasteur à grande pointe remplie d’aLCR.
- Placez la tranche dans le puits MEA et ajoutez de l’aCSF supplémentaire.
- Placez la tranche sur le réseau d’enregistrement à 60 électrodes à l’aide d’un pinceau fin à poils courts. Évitez d’entrer en contact avec les électrodes avec le pinceau ou de faire glisser le tissu sur les électrodes, surtout si vous utilisez des réseaux 3D.
note: Selon la disposition de la MEA, cela peut être fait avec ou sans l’aide d’un microscope pour un positionnement précis.
- Après avoir positionné la tranche, placez un filet lesté sur le tissu pour le maintenir en place et favoriser un bon contact avec les électrodes MEA.
note: La tranche peut avoir besoin d’être repositionnée après la mise en place du filet.
- Placez le MEA dans la tête d’écoute de l’enregistrement (Figure 2A, B).
- Vérifiez la position du tissu sur les électrodes à l’aide d’un microscope inversé (grossissement 2x) pour confirmer que le plus grand nombre possible d’électrodes se trouvent sous la corne dorsale superficielle (SDH). Assurez-vous qu’au moins 2 à 6 électrodes n’entrent pas en contact avec la tranche, car ces électrodes sont importantes pour soustraire le bruit et enregistrer les artefacts pendant l’analyse (Figure 2E).
- Allumez l’appareil photo, connectez-le à l’appareil et prenez une image de référence de la tranche par rapport à la MEA pour l’utiliser pendant l’analyse.
- Appuyez sur Start DAQ (acquisition de données) dans le logiciel d’enregistrement et confirmez que toutes les électrodes reçoivent un signal clair.
note: Si le signal est bruyant, déclipsez la scène et nettoyez les pastilles de contact MEA et les contacts à ressort doré avec de l’éthanol à 70 % (utilisez une lingette de laboratoire pour vous assurer que les pastilles et les contacts sont secs après le nettoyage). Si le signal est toujours bruyant, éteignez les électrodes défectueuses dans le logiciel d’enregistrement ou notez-le pour exclusion plus tard pendant l’analyse.
- Fixez les conduites d’entrée et de sortie de perfusion au puits MEA (préalablement rempli d’aCSF) et allumez le système de perfusion. Vérifiez le débit, idéalement de 4 à 6 volumes de bain par minute, et assurez-vous que le débit sortant est suffisant pour éviter le débordement du superfusat.
- Laissez le tissu s’équilibrer pendant 5 minutes, puis enregistrez 5 minutes de données de base brutes et non filtrées.
- Déplacez la ligne d’entrée de perfusion du LCR aC vers une solution 4-AP et attendez 12 min pour que l’activité rythmique induite par 4-AP atteigne l’état d’équilibre (2 min pour que les médicaments atteignent le bain et 10 min pour que l’activité atteigne son pic puis se stabilise).
- Enregistrez 5 min d’activité induite par le 4-AP. Soyez prêt pour les enregistrements ultérieurs afin de tester les médicaments ou de vérifier la stabilité du 4-AP.
Tableau 1 : Compositions de liquide céphalo-rachidien artificiel.
| chimique | aCSF (mM) | aLCR (g/100 mL) | LCRa substitué par du saccharose (mM) | LCa substitué par du saccharose (g/100 mL) | ACSF à haute teneur en potassium (mM) | LCR a-potassium élevé (g/100 mL) |
| Chlorure de sodium (NaCl) | 118 | 0,690 | - | - | 118 | 0,690 |
| Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 |
| glucose | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 |
| Chlorure de potasium (KCl) | 2.5 | 0,019 | 2.5 | 0,019 | 4.5 | 0,034 |
| Dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4) | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 |
| Cloure de magnésium (MgCl2) | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 |
| Chlorure de calcium (CaCl2) | 2.5 | 0,028 | 2.5 | 0,028 | 2.5 | 0,028 |
| saccharose | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tableau 2 : Dispositions des réseaux de microélectrodes.
| Dispositions des réseaux de microélectrodes |
| Modèle de réseau de microélectrodes | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Planaire ou tridimensionnel (3D) | planaire | 3d | 3d | planaire |
| Grille d’électrodes | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 x 10 |
| Espacement des électrodes | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Diamètre de l’électrode | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Hauteur de l’électrode (3D) | n/a | 40 μm | 50 μm | n/a |
| Expériences | Tranche transversale | Tranche transversale | Sagittal + Horizontal | Sagittal + Horizontal |
