Enregistrement des changements dans l’activité du nerf sympathique rénal en réponse à la pression artérielle chez le rat

Résumé

Source : Fink, A. M., et al. Quantification des changements aigus de l’activité du nerf sympathique rénal en réponse à des manipulations du système nerveux central chez des rats anesthésiés. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente une technique d’étude de l’activité des nerfs sympathiques rénaux (RSN) en réponse aux changements de pression artérielle chez le rat. Lors de la fixation d’un cathéter sensible à la pression à l’artère fémorale, les nerfs sympathiques rénaux sont exposés. Les nerfs sont ensuite soulevés sur une électrode d’enregistrement, et leur activité électrique est enregistrée. Ensuite, un médicament vasoconstricteur est injecté pour élever la pression artérielle, et les changements correspondants dans l’activité du RSN sont surveillés.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Créer des électrodes RSNA bipolaires

1. Pour créer l’électrode, coupez deux morceaux de fil d’acier inoxydable d’environ 18 mm de long chacun. Coupez un morceau de tube en polyéthylène (PE-50) d’environ 15 mm de long. Faites passer les deux morceaux de fil dans le tube, en laissant le fil dépasser des deux extrémités.
2. Retirez l’isolant des extrémités des fils ; coupez les fils en laissant 2-3 mm de fil exposé. À une extrémité, sertir les broches mâles sur le fil exposé. Soudez solidement les broches au fil, fixez les broches à l’intérieur d’une bande de connecteur et couvrez la connexion avec epoxy.
   note: Une autre approche qui évite la soudure consiste à utiliser des pinces crocodiles à connexion/libération rapide.
3. À l’extrémité opposée de l’électrode, retirez l’isolant des extrémités des fils, en laissant 2-3 mm de fil exposé. Pliez cette partie des fils pour créer de petits crochets en forme de « V » dans le fil non isolé.
   note: Il s’agit de la partie de l’électrode qui sera en contact avec le nerf sympathique rénal. Il est important de sceller cette extrémité pour éviter que des fluides ne pénètrent dans le tube. Le silicone ou l’époxy peuvent être utilisés efficacement.

2. Administrer l’anesthésie et préparer les sites chirurgicaux

1. Administrer l’anesthésie à un rat Sprague Dawley mâle (âgé de 9 à 11 semaines, pesant de 150 à 400 g). Administrer le pentobarbital sodique 50 mg/kg par injection intrapéritonéale (IP). Pour évaluer un plan d’anesthésie stable pendant la chirurgie, vérifiez le réflexe de pincement des orteils toutes les 15 minutes et redosez l’anesthésie si nécessaire.
   note: Le pentobarbital sodique (Nembutal) a été utilisé dans des études antérieures pour obtenir un plan d’anesthésie soutenu sans interférer avec la modulation du RSNA. Ce protocole est destiné à la chirurgie de non-survie, il n’y a donc pas de période de récupération/surveillance postopératoire.
2. Préparez le site chirurgical conformément aux directives de l'établissement en matière de soins aux animaux (c.-à-d. rasez l'abdomen, le dos et la tête du rat, nettoyez la peau avec une solution de povidone iodée à 10 %, appliquez un lubrifiant pour les yeux et placez le rat sur un coussin chauffant). Maintenez la température corporelle à 37 °C pendant les expériences.

3. Canuler l’artère fémorale pour la surveillance de la pression artérielle moyenne

1. Visualisez l’artère au microscope. Semblable à la méthode utilisée pour la canulation veineuse, attachez la suture distale pour occlure l’artère ; Fixez les bords de cette suture au champ chirurgical avec du ruban de soie et positionnez l'artère perpendiculairement à la main dominante du chirurgien.
2. Accès artériel en cas d’utilisation de la télémétrie
   1. Inspectez le cathéter sensible à la pression sous un fort grossissement avant la canulation artérielle. Assurez-vous que le cathéter est exempt de bulles ou de débris et qu’il a un ménisque intact entre les composants remplis de liquide (proximaux) et remplis de gel (distal). Avant chaque implantation, remplissez à nouveau le gel à l’extrémité distale du cathéter. Allumez l’émetteur à l’aide d’un aimant ; surveiller la pression artérielle (PA) pendant la chirurgie pour supporter un placement parfait.
   2. Utilisez un demi-nœud lâche dans la suture proximale pour occlure brièvement l’artère fémorale. Tenez l’introducteur de cathéter dans la main non dominante. Tenez l’extrémité de la canule de l’unité de télémétrie à l’aide d’une pince à canulation vasculaire pour éviter de déplacer le gel de la pointe.
   3. Percez un trou dans l’artère avec l’aiguille 22G pliée et insérez la canule dans l’artère à l’aide d’une pince à canulation vasculaire pour éviter de déplacer le gel de l’extrémité. Avancez la canule le plus loin possible. À l’aide des attaches de suture proximales et distales, fixez le cathéter de pression.
   4. Rentrez le corps de l’implant de télémétrie à l’intérieur du flanc adjacent à l’incision et fermez cette incision à l’aide d’une suture en nylon 4-0 sur une aiguille coupante. Éteignez les appareils de télémétrie à l’aide d’un aimant à la fin de la période d’enregistrement pour économiser la batterie.

4. Positionner le rat dans le cadre de chirurgie stéréotaxique pour accéder au cerveau

1. Déplacez doucement le rat en position couchée dans le cadre de la chirurgie stéréotaxique.
2. Positionnez le rat entre les barres auriculaires et ajustez la barre incisive pour égaliser la hauteur du lambda et du bregma. Le positionnement peut dépendre de la tension du rat, du poids et de l’emplacement des cibles du système nerveux central (SNC).
3. Faites une incision rostrocaudale de 2 cm au scalpel à travers la ligne médiane du cuir chevelu. À l’aide d’applicateurs à embout de coton, retirez fermement le tissu conjonctif de la surface du crâne. Appliquez du peroxyde d’hydrogène sur le crâne pour aider à visualiser les sutures bregma, lambda et médiane.
4. À l’aide d’un atlas du cerveau du rat pour guider le ciblage, percez une ostéotomie à trou de bavure, dimensionnée pour l’accès aux électrodes, à travers le crâne.

5. Isoler les nerfs sympathiques rénaux

1. Connectez l’électrode RSNA filaire (étapes 1.1-1.3) à un préamplificateur 10X et à un amplificateur de microélectrode.
2. Isolez les nerfs rénaux par une incision rétropéritonéale avant ou après que le rat soit fixé dans le cadre stéréotaxique. Positionnez les électrodes RSNA une fois que le rat est dans le cadre stéréotaxique. Faites une incision au scalpel s’étendant de 4 à 5 cm sous les côtes dans le sens caudal, légèrement latéralement à la colonne vertébrale. Blunt dissèque l’incision pour visualiser les muscles paraspinaux.
3. Utilisez des ciseaux pour faire une incision rostrocaudale très superficielle de 1 à 2 cm où la graisse rencontre le muscle. À l’aide d’applicateurs à bout de coton, étalez la graisse loin du muscle pour visualiser le rein. Il est important de ne pas entrer dans l’espace péritonéal.
4. Utilisez des écarteurs pour séparer doucement le rein des muscles paraspinaux afin de visualiser l’artère rénale et l’aorte abdominale. N’étirez pas excessivement les vaisseaux pour éviter d’endommager les nerfs rénaux. Utilisez un tampon de gaze de coton de 2 po x 2 po imbibé de solution saline pour protéger les reins des blessures.
5. Sous un grossissement élevé, identifiez les nerfs rénaux dans la poche d’incision. Les faisceaux nerveux sont plus facilement visibles dans l’angle droit formé par l’aorte et l’artère rénale. Les nerfs rénaux suivent de près l’artère rénale de l’aorte aux reins.
6. Sélectionnez un segment du faisceau nerveux qui sera placé sur l’électrode d’enregistrement. Disséquez doucement les fibres nerveuses des tissus/vaisseaux environnants à l’aide d’une pince à épiler micro-dissectionnante.
7. Fixez l’électrode RSNA dans un support (par exemple, une pince crocodile fixée à un support de support). Abaissez l’électrode au niveau du segment nerveux. À l’aide d’un crochet nerveux, soulevez doucement le segment du nerf rénal sur l’électrode sans étirer le nerf.
   note: Le nerf doit reposer à l’intérieur des deux crochets en forme de « V » dans le fil non isolé, parallèlement au nerf. Les fils d’électrodes ne doivent pas toucher d’autres tissus, sang ou lymphe.
8. Remplissez l’incision avec de l’huile minérale pour éviter que le nerf sympathique rénal exposé ne devienne sec. Utilisez une pince de mise à la terre avec une extrémité sur la peau de l’incision et l’autre attachée à la cage de Faraday.
9. Dirigez le signal vers les amplificateurs à l’aide d’un filtrage passe-haut et passe-bas (10 Hz et 3 kHz). Ajustez le gain jusqu’à 10 K. Incluez un moniteur audio pour évaluer le modèle de rafale du RSNA. Utilisez des fréquences d’échantillonnage comprises entre 2 000 et 10 000 Hz. Utilisez une fréquence d’échantillonnage accrue lorsqu’on suppose qu’une manipulation du SNC provoque des réponses sympathiques rapides ou brèves.

6. Enregistrer les données

1. Évaluer la qualité de l’enregistrement RSNA en évoquant le baroréflexe avec une injection en bolus de 1 mL de solution saline ou de 10 μg/mL de phényléphrine (dans 0,1 mL) par voie intraveineuse. Comme illustré sur la figure 1, la perfusion devrait augmenter la PA et inhiber le RSNA. Une augmentation de la pression artérielle moyenne de 60 à 80 mmHg est suffisante pour la sympathoinhibition rénale.
2. Ajustez la position des électrodes pour améliorer le signal si nécessaire. Un repositionnement est nécessaire si le nerf n’est pas en contact avec les deux crochets de l’électrode ou si des tissus, du sang ou de la lymphe sont en contact avec les fils.
   note: La nécessité d’un repositionnement est basée sur les caractéristiques auditives des décharges nerveuses.
3. Une fois qu’un signal clair est obtenu, fixez l’électrode RSNA en place en prélevant l’huile minérale et en appliquant un gel de silice pour couvrir la connexion nerf/électrode dans la poche d’incision. Ne bougez pas le rat avant que le gel n’ait complètement pris.
4. Effectuez des protocoles de manipulation du SNC tout en enregistrant en continu le RSNA et la pression artérielle moyenne. Si un micro-injecteur/émetteur est utilisé pour les manipulations du tronc cérébral, un signal logique de ce dispositif peut être introduit dans les enregistrements RSNA/BP pour documenter le moment des manipulations du SNC.
5. Une fois l’expérience terminée, déterminez le niveau de bruit en écrasant le nerf proximal aux électrodes d’enregistrement entre le gel de silice et le muscle rachidien. Enregistrez au moins 30 s de cette valeur « zéro » pour RSNA. Comme autre approche pour quantifier le bruit, administrer un bloqueur ganglionnaire à courte durée d’action tel que l’atropine, l’hexaméthonium, la chlorisondamine ou le tartrate de pentolinium.
6. Retirez avec précaution l’électrode RSNA et éliminez toute trace de gel de silice des fils-électrodes. Conservez l’électrode pour la réutiliser. Éteignez l’émetteur de télémétrie et retirez-le en prenant soin de ne pas endommager l’extrémité du cathéter.

Résultats

Figure 1 : RSNA et PA en réponse à l’injection de phényléphrine IV.Le RSNA brut (A) était redressé à pleine onde (B) ; le RSNA « zéro » broyé rectifié est illustré dans l’encart C. Des moyennes de 10 s non chevauchantes (moins le bruit) ont été calculées (D). Pour évoquer le baroréflexe, 0,1 mL de phényléphrine (1 μg/mL) a été...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fil d’acier inoxydable	Systèmes A-M ; Sequim, État de Washington	Référence 791000	Électrode RSNA
Tubes en polyéthylène (PE-50)	VWR ; Radnor, Pennsylvanie	Référence 63019-048	Électrode RSNA ; canulation du récipient
Connecteur à broches miniature	Systèmes A-M ; Sequim, État de Washington	Référence 520200	Électrode RSNA
Pince	Daniels Manufacturing Corp. ; Orlando, Floride	Référence M22520	Électrode RSNA
Bande de connexion	Amphenol ; Clinton Township, Michigan (États-Unis	Référence 221-2653	Électrode RSNA
J-B Kwik Époxy	J-B Weld, Sulphur Springs, Texas	Référence 8270	Électrode RSNA
silicone	Permatex ; Hartford, Connecticut	Référence 2222	Électrode RSNA
Héparine sodique ; Injectable (flacon de 10 ml, 1000 U/mL)	KV Approvisionnement vétérinaire ; David City, NE	Réf. P03466	Perméabilité des lignes veineuses
HCl de phényléphrine ; Injectable (fiole de 1 mL ; 10 mg/mL)	Approvisionnement chirurgical ACE ; Brockton, Massachusetts (États-Unis	Référence 950-6312	Test de la sympathoinhibition rénale
Haubans chirurgicaux élastiques à crochet unique	Appareil de Harvard ; Holliston, MA	Référence 72-2595	incision
Ruban chirurgical en soie	3M, Minneapolis, Minnesota	Référence 1538-0	Séjours chirurgicaux sécurisés
Aiguilles, 20 g	Sigma-Aldrich ; Saint-Louis, MO	Z192554-100EA	Canulation du récipient
Pince incurvée Dumont #7	Outils scientifiques fins ; Foster City, Californie	Référence 11274-20	Canulation du récipient
5-0 attaches de suture en soie	Braintree Scientific ; Braintree, Massachusetts (États-Unis	SUT-S 106	Canulation du récipient
Pince hémostatique délicate	Roboz Surgical Instrument Co. ; Gaithersburg, Maryland	RS-7117	Canulation vasculaire et chirurgie RSNA
Pince hémostatique Crile	Outils scientifiques fins ; Foster City, Californie	Référence 13004-14	Cintrage à l’aiguille
Émetteur de télémétrie	Data Sciences International ; Minneapolis, Minnesota	PA-10	Surveillance de la pression artérielle moyenne (télémétrie)
Seringue de ré-gel	Data Sciences International ; Minneapolis, Minnesota	Référence 276-0038-001	Réutilisation de l’émetteur (télémétrie)
Transducteur de pression jetable	Transpac ; San Clemente, Californie	MI-1224	Surveillance de la pression artérielle moyenne
Infuseur à pression Clear-Cuff	MILA International Inc. ; Florence, Kentucky	2281339	Surveillance de la pression artérielle moyenne
Pince à canulation de récipient	Outils scientifiques fins ; Foster City, Californie	Référence 00574-11	Insertion du cathéter
Suture en nylon monofilament noir 4-0 sur aiguille de coupe inversée	McKesson Médico-Chirurgical ; San Francisco, Californie	S661GX	Émetteur de télémétrie sécurisé
Récepteur de télémétrie	Data Sciences International ; Minneapolis, Minnesota	RPC-1	Surveillance de la pression artérielle moyenne (télémétrie)
LabChart Pro (logiciel), PowerLab (matériel d’acquisition)	Instruments CN ; Colorado Springs, Colorado (Colorado	ML846, matrice MX2 2.0 (compatible avec la télémétrie Data Science International)	3 options pour le logiciel/matériel d’acquisition
SciWorks (logiciel), DataWave (matériel d’acquisition)	DataWave Technologies, Loveland, Colorado	n/a
Spike 2 (logiciel), Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., Londres, Royaume-Uni	Référence 1401-3
Micro-perceuse	Roboz Surgical Instrument Co. ; Gaithersburg, Maryland	RS-6300	Chirurgie du SNC
Cadre de chirurgie stéréotaxique	Stoelting ; Wood Dale, Illinois	Référence 51600	Chirurgie du SNC
Amplificateur à microélectrodes avec préamplificateur 10X	Systèmes A-M ; Sequim, État de Washington	1800-2	Enregistrement RSNA
Rétracteurs	Outils scientifiques fins ; Foster City, Californie	Référence 17009-07	Enregistrement RSNA
Pince à épiler micro-dissection	Outils scientifiques fins ; Foster City, Californie	Référence 11251-10	Enregistrement RSNA
Micro-crochet	Outils scientifiques fins ; Foster City, Californie	Référence 10064-14	Enregistrement RSNA
huile minérale	Fisher Scientific ; Waltham, Massachusetts (États-Unis	Référence 8042-47-5	Enregistrement RSNA
Moniteur audio	Systèmes A-M ; Sequim, État de Washington	3300	Enregistrement RSNA
Gel de silice	Wacker, München ; Allemagne	RT601A-B	Enregistrement RSNA
Pinces électriques	Tyco Electronics ; Schaffhouse, Suisse	EB0283-000	Mise à la terre ou sécurisation de l’aiguille de perfusion
Ciseaux de Bonn, pointes droites/pointues	Roboz Surgical Instrument Co ; Gaithersburg, Maryland	RS-5840	perfusion
Aiguille à gavage	Appareil de Harvard ; Holliston, MA	Référence 75-0286	perfusion
Pompe à perfusion Masterflex	Cole-Parmer ; Vernon Hills, Illinois	Référence 7524-10	perfusion
Tube en silicone durci au platine Masterflex	Cole-Parmer ; Vernon Hills, Illinois	Référence 96410-15	perfusion
Formol (solution tamponnée à 10 %; 4 L)	Sigma-Aldrich ; Saint-Louis, MO	HT501128	perfusion
saccharose	Sigma-Aldrich ; Saint-Louis, MO	S0389	Cryoprotection