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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Enregistrements patch-clamp de cellules entières
- Transférez la première section de tissu dans la chambre d’enregistrement immergée dans un flux continu de solution de Krebs. Montez la section à l’aide de poids légers et immergez l’objectif.
- Identifiez la région striatale au microscope et recherchez des neurones positifs à la GFP (reprogrammés). Sélectionnez un neurone dont la morphologie est extensive et qui n’est pas couvert par des faisceaux de fibres ou des vaisseaux sanguins.
- Préparez des pipettes en verre borosilicaté (3 à 7 MΩ) pour le colmatage et remplissez-les avec la solution intracellulaire suivante (en mM) : gluconate de potassium 122,5, 12,5 KCl, 0,2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,3 Na3GTP et 8 NaCl, ajustés à pH 7,3 avec KOH.
- Fixez la pipette en verre à l’électrode d’enregistrement et trempez-la dans la solution. Vérifiez la résistance de l'électrode. Ensuite, approchez-vous lentement de la cellule avec la pipette en gardant une légère pression positive sur l’électrode pour éviter de boucher l’embout.
prudence: Veillez à garder une trace de votre cellule pendant que vous descendez l’électrode et à ne pas blanchir la fluorescence dans la cellule (c’est-à-dire éteignez la lampe à fluorescence lorsque vous n’en avez pas besoin).
- Rincez soigneusement les tissus environnants en utilisant la pression positive de l’électrode et approchez-vous de la cellule avec l’électrode. Placez l’électrode juste au-dessus de la cellule et descendez jusqu’à ce que l’électrode touche la membrane. Faites un joint Giga-Ω entre l’électrode et la membrane de la cellule, et avec des impulsions de pression négative, rompez la membrane pour créer un patch de cellule entière.
prudence: Les neurones reprogrammés sont sensibles. Soyez prudent lors du patchage et n’exercez pas trop de pression négative lorsque vous atteignez un joint Giga-Ω ou ouvrez la membrane cellulaire. De plus, le patching sur des animaux plus âgés nécessite de la pratique et de la patience, car leur tissu conjonctif est plus épais et il est plus difficile de visualiser les neurones.
- Vérifiez les potentiels de membrane au repos immédiatement après l’effraction en mode pince de courant et notez-les pour analyse.
- Dans la pince ampèremétrique, maintenez la cellule entre -60 mV et -80 mV et injectez des courants de 500 ms de -20 pA à +90 pA, avec des incréments de 10 pA pour induire des potentiels d’action.