Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de l’animal pour l’imagerie
- Placez de la gaze stérile, des cotons-tiges et des outils chirurgicaux autoclavés dans la zone de chirurgie. Allumez un stérilisateur à microbilles pour la stérilisation interchirurgicale des outils chirurgicaux.
- Anesthésier la souris (mâle ou femelle, 1,5 à 2,5 mois, 20 à 25 g) par injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (17,2 mg/mL), de xylazine (0,475 mg/mL) et d’acépromazine (0,238 mg/mL) (6 μL/g de poids corporel). Attendez que la profondeur appropriée de l’anesthésie soit atteinte lorsque l’animal cesse de répondre à un stimulus de pincement des orteils et n’a pas de réflexe cornéen. Pendant la chirurgie, donnez une dose de rappel de 1/3 de la dose originale du cocktail anesthésique au besoin pour maintenir l’état anesthésique d’origine.
- Injecter de la buprénorphine par voie sous-cutanée (s.c. ; 0,05 à 0,10 mg/kg) comme agent analgésique avant la chirurgie. Appliquez une pommade protectrice sur les yeux de l’animal pour prévenir le dessèchement de la cornée et la formation de cataracte.
- Placez une souris transgénique GCaMP6s sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie et couvrez-la d’un champ chirurgical stérile. Stabilisez la tête de l'animal avec un adaptateur de maintien de la tête pour souris.
- Rasez la tête sur la majeure partie du cuir chevelu avec une lame de rasoir à double tranchant. Nettoyez la zone chirurgicale à l’aide d’un tampon de préparation d’alcool stérile, puis d’une solution de povidone iodée.
2. Préparation chronique de la fenêtre crânienne
- Faites une coupe rectangulaire du cuir chevelu (2 mm x 3 mm) avec une paire de ciseaux sur un côté (à droite) du crâne. Écartez la peau à l’aide d’un coton-tige pour créer une zone d’exposition de >3 mm de diamètre (figure 1A). Retirez le tissu conjonctif attaché au crâne en grattant doucement le crâne avec une lame microchirurgicale émoussée (Scalpel Blade #10 ; Figure 1C).
- Marquez la zone S1 en dessinant doucement un cercle (3 mm de diamètre, coordination centrale : -1,5 mm à partir du bregma et 2,5 mm à partir de la ligne médiane) sur le crâne à l’aide d’une perceuse dentaire (Figure 2B).
- Effectuez la même procédure sur le crâne gauche (Figure 2B).
- Appliquez une fine couche de super colle cyanoacrylate sur l’os pour fournir une base pour l’application de ciment dentaire.
- À l’aide d’un microscope à dissection, amincir un sillon circulaire dans le crâne autour de la zone S1 à l’aide d’une microperceuse à grande vitesse (figure 1D). Le but est de créer un bord lisse pour le placement d’une fenêtre optique dessus.
- Appliquez à plusieurs reprises du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF, température ambiante) sur le crâne périodiquement pendant le processus d’amincissement pour faciliter le forage et dissiper la chaleur. Effectuez le forage par intermittence pour éviter la surchauffe induite par le frottement. Aspirez les débris osseux à l’aide d’une conduite d’aspiration domestique ou d’une pompe à vide.
- Après avoir percé environ 2/3 de profondeur de l’os, amincissez lentement et soigneusement le 1/3 d’os restant jusqu’à ce qu’un morceau circulaire du crâne (lambeau osseux) soit complètement libre du crâne environnant.
- Retirez lentement et soigneusement le rabat osseux circulaire à l’aide d’une paire de pinces # 5/45 et exposez la dure-mère (Figure 2C ; Figure 1E).
- Gardez la région du cerveau exposée humide avec de l’ACSF (Figure 1E). Évitez d’endommager les vaisseaux piaux, car l’hémorragie modifiera le flux sanguin cérébral, accélérera l’enflure du cerveau et dégradera gravement la qualité de l’imagerie.
- Effectuez la même procédure sur le côté gauche (controlatéral) du crâne.
- Pour assembler la fenêtre optique, utilisez un adhésif optique pour coller et durcir entre les couches de verre une à la fois. Si nécessaire, réchauffez la fenêtre optique (50 °C pendant 12 h) dans un incubateur pour favoriser la liaison adhésive. La fenêtre optique se compose de 2 parties : la partie supérieure contient un seul verre de protection rond d’un diamètre de 5 mm et la partie inférieure contient 1 à 3 verres de protection ronds d’un diamètre de 3 mm (figure 2D).
- Conservez la fenêtre optique dans de l’éthanol (70 %, vol/vol) et rincez-la avec une solution saline stérile avant utilisation. Avant l’installation de la fenêtre optique, vérifiez qu’elle ne présente pas d’imperfections, notamment une quantité incorrecte d’adhésif optique ou un alignement imprécis sous un stéréoscope.
- Installez la fenêtre optique sur la région de la craniotomie (Figure 2D). La partie supérieure de la fenêtre optique repose sur le crâne, et la partie inférieure de la fenêtre optique s’insère dans l’ouverture craniotomisée et repose sur la dure-mère en présence de LCR (Figure 2D, E).
- Scellez la partie supérieure du bord de la fenêtre optique sur le crâne avec la super colle cyanoacrylate (Figure 2F ; Figure 1F).
- Lorsque la super colle cyanoacrylate a séché, appliquez du ciment dentaire noir (Dentsply) pour couvrir le bord du verre. Appliquez du ciment dentaire sur tous les bords exposés du crâne et de la plaie pour bloquer la lumière (figure 2G-H ; Figure 1B).
- Effectuez la même procédure sur le côté gauche.
- Laissez l’animal se rétablir sur le coussin chauffant et retournez-le dans sa cage d’origine pour qu’il se rétablisse sous une surveillance appropriée. Fournissez de la nourriture humide pour faciliter la mastication et l’hydratation. Pour réduire la douleur, administrez de la buprénorphine s.c. (0,05 à 2,0 mg/kg) toutes les 8 à 12 heures après la blessure pendant 2 jours. Laissez la souris récupérer pendant 7 à 10 jours supplémentaires avant l’imagerie.
