Enregistrement par patch clamp de cellules entières dans un neurone de la substance gélatinosa d’une coupe de moelle épinière

Résumé

Source : Zhu, M., et al. Préparation de coupes aiguës de moelle épinière pour l’enregistrement par patch-clamp de cellules entières dans les neurones de la substance gélatineuse. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la procédure d’exécution d’enregistrements électrophysiologiques dans les neurones de la substance gélatinosa (SG) de coupes de moelle épinière, en utilisant des techniques de patch-clamp de cellules entières pour analyser les modèles de décharge des neurones. Cette méthode permet d’étudier les réponses neuronales aux stimuli dans les neurones SG de la moelle épinière.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par l’examen éthique approprié des animaux.

1. Préparation des solutions et des matériaux

1. Solutions
   1. Préparez du liquide céphalo-rachidien artificiel (en mM) : 117 chlorure de sodium (NaCl), 3,6 chlorure de potassium (KCl), 1,2 dihydrogénophosphate de sodium dihydraté (NaH₂PO₄·2H₂O), 2,5 chlorure de calcium dihydraté (CaCl₂·2H₂O), 1,2 chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl₂·6H₂O), 25 bicarbonate de sodium (NaHCO₃), 11 D-glucose, 0,4 acide ascorbique, et 2 pyruvate de sodium. Voir le tableau 1.
   2. Préparez une solution intracellulaire à base de K⁺ (en mM) : 130 K-gluconate, 5 KCl, 10 Na 2-phosphocréatine, 0,5 éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique (EGTA), 10 acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 4 adénosine triphosphate de magnésium (Mg-ATP) et 0,3 lithium guanosine triphosphate (Li-GTP). Voir le tableau 2.
   3. Préparez une solution intracellulaire à base de césium (Cs⁺) (en mM) : 92 sulfonate de méthane de césium (CsMeSO₄), 43 chlorure de césium (CsCl), 10 Na 2-phosphocréatine, 5 tétraéthylammonium (TEA)-Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP et 0,3 Li-GTP. Voir tableau 3.
      note: Toutes les solutions doivent être préparées à l’aide d’eau distillée. L’ACSF et le saccharose-ACSF doivent être carbogénés (mélange de 95 % d’O₂ et 5 % de CO₂) avant d’être utilisés pour maintenir un pH optimal d’environ 7,4, et l’osmolalité de ces deux solutions doit être ajustée à 300-310 milliosmols (mOsm). Parce que l’acide ascorbique pourrait affecter les canaux calciques, cet agent doit être omis si l’on souhaite enregistrer les courants calciques. L’osmolalité et le pH des solutions intracellulaires doivent être mesurés et ajustés à 290-300 mOsm et 7,2-7,3, respectivement. Il est recommandé de filtrer les solutions intracellulaires à l’aide de filtres de 0,2 μm et de stocker les solutions sous forme d’aliquotes de 1 mL à -20 °C. Cs⁺ et TEA sont appliqués dans une solution intracellulaire à base de Cs⁺ pour bloquer le canal potassique, ce qui est propice à l’utilisation de l’amplificateur pour maintenir le potentiel membranaire stable à 0 mV lors de l’enregistrement de courants postsynaptiques inhibiteurs (IPSC).
2. Instruments
   1. Pour un système électrophysiologique typique, utilisez un microscope droit équipé d’un contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) et d’un objectif à immersion dans l’eau haute résolution, une caméra CCD/CMOS, un amplificateur patch-clamp, un porte-micropipette et un micromanipulateur permettant un réglage précis de la position de la pipette. Une platine XY est également nécessaire pour déplacer le microscope.
   2. Montez tout l’équipement sur une table d’isolation des vibrations entourée d’une cage de Faraday. Connectez un moniteur vidéo à la caméra vidéo pour observer les neurones et visualiser les micropipettes.
3. Micropipettes
   1. Fabriquez des électrodes d’enregistrement à partir de capillaires en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de micropipette. La résistance typique d’une pipette varie de 3 à 6 MΩ lorsqu’elle est remplie d’une solution intracellulaire.

2. Enregistrements de patch-clamp à cellules entières

1. Pour effectuer les enregistrements patch-clamp de cellules entières à partir de neurones de la substance gélatinosée (SG), utilisez une solution intracellulaire à base de K⁺ pour la plupart des cas d’enregistrement, tout en appliquant une solution à base de Cs⁺ uniquement pour l’enregistrement des courants postsynaptiques inhibiteurs.
2. Déplacez doucement une tranche de moelle épinière vers la chambre d’enregistrement, puis maintenez-la avec un fil de platine en forme de U fixé fermement avec des fils de nylon pour une stabilité optimale de la tranche. Perfuser régulièrement la tranche avec de l’ACSF à bulles à RT à travers un système de gravité et régler le débit de perfusion à 2-4 ml/min pour obtenir une oxygénation suffisante.
3. Identifiez la région de SG (une bande translucide) à l’aide d’une lentille de microscope à basse résolution, choisissez un neurone sain en utilisant l’objectif haute résolution comme cellule cible et ajustez-le au centre de l’écran du moniteur vidéo.
4. Remplissez une micropipette avec un volume approprié de solution intracellulaire à base de K⁺ ou de Cs⁺ selon les besoins, insérez la micropipette dans le porte-électrode et assurez-vous que la solution intracellulaire entre en contact avec le fil d’argent à l’intérieur du support.
5. Faites la mise au point sur la micropipette, immergez-la dans l’ACSF à l’aide d’un micromanipulateur, puis appliquez une légère pression positive (~1 psi lorsqu’elle est mesurée avec un manomètre) pour éloigner la micropipette de toute saleté et débris.
6. Déplacez progressivement la micropipette vers le neurone ciblé. Relâchez la pression positive une fois que la pipette s’approche du neurone, et une très petite fossette se forme sur la membrane neuronale pour former un gigaseal.
7. Modifier le potentiel de rétention à -70 mV, ce qui est proche du potentiel membranaire physiologique de repos (RMP) d’une cellule. Ensuite, appliquez une aspiration transitoire et douce sur la micropipette pour rompre la membrane et créer une bonne configuration de cellules entières.
   note: Après avoir transféré la tranche dans la chambre d’enregistrement, assurez-vous d’une perfusion régulière pendant au moins 5 minutes pour éliminer les débris à la surface de la tranche. Il convient de noter que la capacité de distinguer les neurones sains et malsains/morts est d’une importance capitale pour une bonne étanchéité et un enregistrement stable. Un neurone malsain/mort a un aspect gonflé ou rétréci, ainsi qu’un gros noyau visible, tandis qu’un neurone sain se caractérise par une forme tridimensionnelle (3D) avec une membrane brillante et lisse, et son noyau est invisible. Pour obtenir une configuration à cellules entières, il est essentiel de compenser progressivement la capacité rapide ou lente si nécessaire. À température ambiante (RT), le potentiel de jonction liquide est calculé à 15,1-15,2 millivolts (mV) et 4,3-4,4 mV dans des solutions intracellulaires à base de K⁺ et de Cs⁺, respectivement. Dans nos études, les données enregistrées n’ont pas été corrigées pour le potentiel de jonction liquide.
8. Enregistrements des propriétés intrinsèques de la membrane
   1. Enregistrez les propriétés de décharge : testez le modèle de décharge de chaque neurone dans la pince de courant avec une série d’impulsions de courant dépolarisant de 1 s (25 à 150 picoampères (pA) avec incrément de 25 pA) à RMP. Mesurez le seuil, l’amplitude et la demi-largeur d’un potentiel d’action unique hors ligne.

Tableau 1 : Recette pour ACSF

composant	masse moléculaire	Concentration (mM)	g/L
NaCl	58,5	117	6,84
Kcl	74,5	3.6	0,27
NaH2PO4·2H2O	156	1.2	0,19
CaCl2·2H2O	147	2.5	0,37
MgCl2·6H2O	203	1.2	0,24
NaHCO3	84	25	2.1
D-Glucose	180	11	1,98
acide ascorbique	198,11	0,4	0,08
Pyruvate de sodium	110	deux	0,22

Tableau 2 : Recette de solution intracellulaire à base de K⁺

composant	masse moléculaire	Concentration (mM)	mg/100 mL
K-gluconate	234,2	130	Référence 3044.6
Kcl	74,5	5	37,28
Na2-phosphocréatine	453,38	10	453,38
EGTA	380,35	0,5	19.02
HEPES	238,31	10	238,3
Mg-ATP	507.18	4	202,9
Li-GTP	Référence 523.18	0,3	15,7

Tableau 3 : Recette de solution intracellulaire à base de Cs⁺

composant	masse moléculaire	Concentration (mM)	mg/100 mL
CsMeSO4	228	92	2097,6
CsCl	168,36	43	723,95
Na2-phosphocréatine	453,38	10	453,38
THÉ-Cl	165,71	5	82,86
EGTA	380,35	0,5	19.02
HEPES	238,31	10	238,3
Mg-ATP	507.18	4	202,9
Li-GTP	Référence 523.18	0,3	15,7

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaCl	sigma	Réf. S7653	Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du PBS
Kcl	sigma	Référence 60130	Utilisé pour la préparation de solutions intracellulaires à base d’ACSF, de saccharose-ACSF et de K+
NaH2PO4·2H2O	sigma	Référence 71500	Utilisé pour la préparation de l’ACSF, du saccharose-ACSF et du PBS
CaCl2·2H2O	sigma	Réf. C5080	Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF
MgCl2·6H2O	sigma	M2670	Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF
NaHCO3	sigma	S5761	Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF
D-Glucose	sigma	Réf. G7021	Utilisé pour la préparation de l’ACSF
acide ascorbique	sigma	P5280	Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF
Pyruvate de sodium	sigma	A7631	Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF
saccharose	sigma	S7903	Utilisé pour la préparation du saccharose-ACSF
K-gluconate	Wako	169-11835	Utilisé pour la préparation d’une solution intracellulaire à base de K+
Na2-phosphocréatine	sigma	P1937	Utilisé pour la préparation d’une solution intracellulaire
EGTA	sigma	E3889	Utilisé pour la préparation d’une solution intracellulaire
HEPES	sigma	N° H4034	Utilisé pour la préparation d’une solution intracellulaire
Mg-ATP	sigma	A9187	Utilisé pour la préparation d’une solution intracellulaire
Li-GTP	sigma	Référence G5884	Utilisé pour la préparation d’une solution intracellulaire
CsMeSO4	sigma	Réf. C1426	Utilisé pour la préparation d’une solution intracellulaire à base de Cs+
CsCl	sigma	Réf. C3011	Utilisé pour la préparation d’une solution intracellulaire à base de Cs+
THÉ-Cl	sigma	Réf. T2265	Utilisé pour la préparation d’une solution intracellulaire à base de Cs+
Na2HPO4	Réactifs chimiques Hengxing		Utilisé pour la préparation du PBS
Capillaires en verre borosilicaté	Instruments de précision mondiaux	TW150F-4	1,5 mm de diamètre extérieur, 1,12 mm de diamètre intérieur
Extracteur de micropipette	Instrument Sutter	P-97	Utilisé pour la préparation de micropipettes
Caméra CCD infrarouge	Dage-MIT	IR-1000
Amplificateur patch-clamp	HEKA	EPC-10
Micromanipulateur	Instrument Sutter	Réf. MP-285
Étage X-Y	Burleigh	GIBRALTAR X-Y
Microscope droit	Olympe	BX51WI
Osmomètre	avancé	FISKE 210
Ph-mètre	Mettler Toledo	FE20