Enregistrement de l’activité électrique cérébrale chez des souris se comportant à l’aide de sondes linéaires en silicium à plusieurs dents

Résumé

Source : Sauer, J., et al. Enregistrement des oscillations spatialement restreintes dans l’hippocampe des souris comportementales. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit un protocole d’implantation d’une sonde linéaire en silicium à plusieurs tiges dans le cerveau de la souris pour mesurer les potentiels de champ local. La procédure consiste à fixer la sonde à une unité stéréotaxique, à la positionner avec précision sur la région cérébrale cible, à l’insérer dans le cerveau et à la fixer avec du ciment dentaire. Après l’implantation, l’ensemble est protégé par un boîtier. Après la récupération, la configuration permet d’enregistrer les potentiels de champ locaux, ce qui donne un aperçu de l’activité neuronale.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparatifs

1. Concevoir et construire un outil d’insertion approprié portant transitoirement la sonde en silicium et le connecteur de l’électrode pendant le processus d’implantation. Voir la figure 1 pour un exemple d’outil d’insertion personnalisé.
2. Libérez soigneusement la sonde en silicium et le connecteur de l’électrode de leur emballage à l’aide d’une pince à pointe en céramique.
3. Soulevez la carte de connexion et fixez-la solidement à l’aide d’une pince crocodile fixée à un support.
4. À l’aide d’un stéréoscope, alignez la sonde avec l’outil d’insertion à l’aide d’une pince à pointe céramique. Appliquez une couche de ~2 mm de cire de paraffine fondue à l’aide d’un cautérisateur pour coller la sonde sur l’outil d’insertion. Veillez à ne pas toucher les tiges de la sonde pendant cette procédure.
5. Fixez le connecteur d’électrode à l’arbre de l’outil d’insertion à l’aide de ruban adhésif standard. Notez que, selon le fabricant, il peut être nécessaire de souder les fils de terre à la carte de connexion de l’électrode avant l’implantation. Retirez l’isolant de deux courts morceaux de fil de cuivre isolés d’un vernis à l’aide d’une soudure à l’étain appliquée avec un fer à souder (400 °C). Soudez les fils de terre aux fentes appropriées de la carte de connexion de l’électrode.
6. Retirez l’isolation de deux morceaux supplémentaires de fil de cuivre. Enroulez chaque fil de cuivre nu trois fois autour d’une vis en acier inoxydable (1 mm de diamètre, 2 mm de longueur). Appliquez un flux adapté à la soudure de l’acier et soudez le fil de cuivre au bas du bouchon à vis. Assurez-vous que la moitié inférieure du filetage de la vis reste exempte de soudure à l’étain.
7. Utilisez un multimètre standard pour vérifier le contact électrique entre le fil et la vis.
8. Désinfecter les tiges de la sonde en silicone et les vis de masse par immersion dans de l’éthanol à 70 % (10 s).
9. Préparez une housse de protection pour l’implant de la sonde en coupant la tête d’une pipette Pasteur en plastique.

2. Chirurgie implantaire

1. Stérilisez les instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces à pointe fine, pinces chirurgicales) avec un stérilisateur à billes chaudes. Essuyez toutes les surfaces avec de l’éthanol à 70 %.
2. Induire une anesthésie avec 3 % d’isoflurane dans l’oxygène délivré à ~1 L/min.
   1. Pour l’entretien, utilisez 1 à 1,5 % d’isoflurane. Notez que la concentration d’isoflurane requise pour atteindre la tolérance chirurgicale peut varier d’un animal à l’autre.
   2. Une tolérance chirurgicale stable est obtenue lorsque l’animal ne répond pas au pincement des orteils. Surveillez le rythme respiratoire de la souris et ajustez la concentration d’isoflurane si nécessaire.
   3. Appliquez de la pommade sur les yeux de l'animal pour éviter qu'il ne se dessèche.
3. Montez la souris dans un cadre stéréotaxique en insérant doucement des barres d’oreille dans le conduit auditif. Une fois que la tête de la souris est stabilisée par les barres d’oreille, placez un embout buccal sur le museau pour une distribution continue d’isoflurane. Placez la souris sur une serviette ou un coussin sur un coussin chauffant et injectez de la buprénorphine par voie sous-cutanée (0,05 à 0,1 mg/kg de poids corporel) pour assurer l’analgésie postopératoire.
4. Rasez la tête avec un rasoir standard et désinfectez la peau avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision dans la peau le long de la ligne médiane du crâne et ouvrez la peau à l’aide de pinces chirurgicales.
5. Alignez la tête de l’animal à l’aide d’un outil d’alignement stéréotaxique pour niveler le bregma et le lambda. Il doit y avoir moins de 50 μm de décalage de hauteur entre bregma et lambda. De plus, nivelez la tête le long de l’axe médiolatéral en mesurant la profondeur du bregma à la surface du crâne à des distances définies à gauche et à droite (par exemple, 1 mm à gauche et à droite du bregma). Ajustez l’inclinaison de la tête si nécessaire.
6. Nettoyez la tête avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % et essuyez-la avec des lingettes en coton stériles.
7. Déterminer l’emplacement de la craniotomie par rapport au bregma à l’aide d’un atlas stéréotaxique approprié.
8. À l’aide d’une tête de forage de 0,9 mm, percez deux trous de vis dans l’os au-dessus du cervelet pour placer les vis de terre et de référence. De plus, 1 à 3 trous pour les vis d’ancrage sont souhaitables pour stabiliser l’implant. L’emplacement des vis d’ancrage dépendra de l’emplacement de la craniotomie. Pour l’implantation dans l’hippocampe, placez les vis d’ancrage sur le cortex pariétal controlatéral et le cortex frontal ipsilatéral. Insérez les vis dans l’os à l’aide d’un tournevis approprié. Veillez à ne pas pénétrer dans le cerveau.
9. Effectuez la craniotomie en amincissant lentement le crâne avec la perceuse dans une zone rectangulaire autour du côté de l’implantation. Humidifiez fréquemment l’os avec un tampon de phosphate (PB) stérilisé. Le crâne aminci restant peut être doucement percé et retiré à l’aide d’une aiguille d’injection fine (27G) et d’une pince à épiler.
10. Percez soigneusement la dure-mère à l’aide d’une fine aiguille d’injection (27G). Formez un petit crochet en pliant la pointe de l’aiguille à l’aide d’une pince à épiler et tirez sur la dure-mère pour la retirer. Appliquez du PB pour empêcher la surface du cerveau de se dessécher.
11. Montez l’outil d’insertion d’électrode sur un support stéréotaxique, mettez la sonde à zéro sur bregma et déplacez la sonde aux coordonnées stéréotaxiques sur la craniotomie. Pénètre lentement la surface du cerveau. Assurez-vous que les arbres de la sonde ne se plient pas. Évitez de l’implanter à travers les vaisseaux sanguins.
12. Abaissez lentement la sonde jusqu’à ~200 μm au-dessus de la profondeur souhaitée. Couvrez la craniotomie et les tiges de la sonde en silicone avec de la vaseline stérilisée pour la protection. Appliquez du ciment dentaire pour fixer la base de la sonde à la vis d’ancrage dans le crâne.
13. Juste après l’application du ciment, déplacez lentement la sonde jusqu’à la profondeur cible. L’avancement des derniers ~200 μm après l’application du ciment réduit le mouvement latéral de la sonde et assure des dommages tissulaires minimaux dans la zone cible. Notez que le temps de durcissement du ciment utilisé peut affecter cette étape du protocole. Avec du ciment à durcissement rapide, omettez cette étape et implantez directement la sonde à la profondeur cible afin d’éviter d’endommager la sonde en silicium.
14. Une fois le ciment durci, libérez la sonde de l’outil d’insertion en faisant fondre la cire avec un cautérisant.
15. Libérez la carte de connexion du dispositif d’insertion et positionnez-la à un endroit approprié sur le crâne à l’aide d’une pince crocodile fixée à la poignée d’insertion. En cas d’implantation de la sonde dans l’hippocampe, placez la planche de connexion sur l’os pariétal controlatéral. Fixez la planche de connexion au crâne à l’aide de ciment dentaire.
16. Soudez les fils de terre et de référence de la carte de connexion aux fils attachés aux deux vis sur le cervelet.
17. Coupez le couvercle de protection à la bonne hauteur et placez-le sur la sonde en silicone. Fixez le couvercle à la planche de connexion et au crâne à l’aide de ciment dentaire, en évitant la peau autour du crâne exposé. Il n’est généralement pas nécessaire de suturer la peau autour du site d’implantation.

3. Récupération après la chirurgie

1. Appliquer un traitement analgésique approprié pendant au moins 2 jours (par exemple, injections sous-cutanées de buprénorphine toutes les 6 heures pendant la journée et dans l’eau de boisson pendant la nuit en association avec du carprofène (4 à 5 mg/kg de poids corporel) par voie sous-cutanée toutes les 24 heures). Un seul logement est recommandé pour éviter d’endommager l’implant.
2. Prévoyez au moins une semaine pour la récupération. Consultez les directives locales en matière de bien-être animal.

4. Acquisition de données

1. Enregistrez les LFP de souris se déplaçant librement à l’aide d’un système d’acquisition de données approprié connecté par un commutateur. Pour acquérir des LFP, utilisez une fréquence d’échantillonnage de 1 à 5 kHz. Des taux d’échantillonnage plus élevés (20 à 30 kHz) sont nécessaires si l’on veut enregistrer les décharges unitaires en même temps que le LFP.
2. Stockez les fichiers d’enregistrement bruts des différents canaux pour une analyse hors ligne.

Résultats

Figure 1 : Image de l’outil d’insertion. La sonde en silicone est fixée à une épingle à insectes collée à la base d’une pince crocodile. La tige du support peut être insérée dans un micromanipulateur stéréotaxique pour l’implantation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince crocodile avec support	Reichelt Elektronik	LICOL ZD-10D
Sonde en silicium	Neurotechnologie de Cambridge	Série P 32
stéréoscope	Olympe	SZ51
Fil de cuivre isolé au vernis	Bürklin Elektronik	89 F 232
Vis de terre	Vis & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
flux	Stannol	114018
Pince à pointe en céramique	Outils scientifiques fins	Référence 11210-60
Cire de paraffine	Sigma-Aldrich	327204
Cautériseur	Outils scientifiques fins	Référence 18010-00
fer à souder	Kurtz Ersa	OIC1300
éthanol	Carl Roth	Référence 9065.1
Pipettes Pasteur	Carl Roth	EA65.1
Stérilisateur thermique	Outils scientifiques fins	Référence 18000-45
Cadre stéréotaxique	David Kopf	Modèle 1900
Porte-électrode stéréotaxique	David Kopf	Modèle 1900
L’isoflurane	Abbvie	Réf. B506
Concentrateur d’oxygène	Respironix	1020007
Buprénorphine	Indivior UK Limited
Rasoir électrique	Tondéo	Eco-XS
Coussin chauffant	Thermolux	463265/-67
Pinces chirurgicales	Outils scientifiques fins	Référence 18050-28
Peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich	N° H1009
Lingettes stériles en coton	Carl Roth	EH12.1
forer	Proxxon	Micromot 230/E
Aiguille d’injection 21G	B. Braun	4657527
Tampon phosphate/solution saline tamponnée au phosphate
Atlas stéréotaxique	Elsevier	9.78E+12
Ciseaux chirurgicaux	Outils scientifiques fins	Référence 14094-11
Pinces chirurgicales	Outils scientifiques fins	Référence 11272-40
Aiguilles d’injection 27G	B. Braun	4657705
vaseline
Ciment dentaire	Sun Medical	SuperBond T&M
Carprofène	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Amplificateur d’enregistrement	Intan Technologies	Réf. C3323
Carte d’acquisition USB	Intan Technologies	Réf. C3004
Câbles d’enregistrement	Intan Technologies	Réf. C3216
Collecteur électrique	Lentilles doriques	HRJ-OE_FC_12_HARW