Réponses postsynaptiques évoquées par la lumière dans les neurones de coupes rétiniennes de souris

Résumé

Source : Hellmer, C. B., et al. Enregistrement des réponses postsynaptiques évoquées par la lumière dans les neurones dans des préparations de coupes rétiniennes de souris adaptées à l’obscurité à l’aide de techniques de patch clamp. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo montre l’enregistrement des réponses post-synaptiques évoquées par la lumière dans une préparation de coupe de tissu rétinien de souris adaptée à l’obscurité. La tranche rétinienne est placée dans une chambre d’enregistrement, et une pipette d’enregistrement est utilisée pour établir une continuité électrique avec une cellule ganglionnaire rétinienne. Des impulsions lumineuses sont appliquées pour générer des potentiels post-synaptiques excitateurs dans les cellules ganglionnaires, qui sont enregistrés par la pipette.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Préparation de la solution expérimentale

1. Préparez la solution de dissection 1 jour à 1 semaine avant l’expérience proprement dite. Utilisez une solution tampon d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthananesulfonique (HEPES) pour la dissection rétinienne en raison de sa forte capacité tampon à des températures plus basses16. Mélanger tous les produits chimiques comme suit (en mM) : 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl₂, 1,0 MgCl₂, 10 HEPES, 28 glucose. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH. Conservez la solution au réfrigérateur jusqu’à 1 semaine.
2. La solution d'enregistrement est le médium d'Ames, qui est un liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) conçu pour les préparations rétiniennes. Le jour de l'expérience, pesez la poudre d'Ames (4,4 g pour 500 ml de solution) dans un tube. Pesez également le NaHCO₃ (0,95 g pour 500 ml de solution) et mélangez-le avec la poudre d'Ames.
3. Préparez la solution de pipette intracellulaire pour les enregistrements à l’aide d’un patch clamp le jour de l’expérience. Mélangez tous les produits chimiques comme suit (en mM) : 111 K-gluconate, 1,0 CaCl₂, 10 HEPES, 1,1 acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA), 10 NaCl, 1,0 MgCl₂, 5 ATP-Mg et 1,0 GTP-Na. Ajustez le pH à 7,2 avec du KOH. Filtrez la solution de pipette avec un filtre à seringue conventionnel. Faites des aliquotes de ~500 μl et conservez-les dans un congélateur ou un congélateur.

2. Préparation pour la journée d’expérimentation

1. La nuit précédant l’expérience, placez une souris dans une cage (C57BL/6J ou fond similaire, âgée de 4 à 8 semaines, mâle) dans un espace sombre pour une adaptation nocturne (O/N) dans l’obscurité.
2. Préparation à la dissection :
   1. Remplissez la solution de dissection (100 - 200 ml) dans un bécher en verre, placez-la sur de la glace et faites bouillir avec de l’oxygène pendant au moins 10 min.
   2. Démarrer l’oxygénation de la boîte noire pour le stockage de la préparation rétinienne.
   3. Préparez des lamelles en plastique avec des rails à graisse pour les préparations de tranches rétiniennes et placez chacune d’entre elles dans un plat en plastique de 35 mm.
   4. Fixez une nouvelle lame de rasoir à un hachoir (trancheuse à tissus).
   5. Coupez une membrane filtrante en deux moitiés. Il s’agit d’un tranchage rétinien.
   6. Alignez les outils de dissection et les pipettes de transfert près du microscope de dissection. La zone de travail doit être bien organisée afin que chaque outil soit facilement accessible dans l’obscurité.
3. Préparation pour les enregistrements par patch clamp :
   1. Dissoudre la poudre d'Ames et le NaHCO₃ dans de l'eau distillée (Ames 4,4 g et NaHCO₃ 0,95 g/500 ml ddH₂O). Faites buliser le milieu d'Ames avec un mélange d'oxygène (95 % O₂ et 5 % CO₂) pendant au moins 30 min tout en chauffant à un niveau de température d'enregistrement (~35 °C). Ajustez le pH à 7,4 avec du NaHCO₃ tout en continuant à bouillonner.
   2. Décongeler la solution interne de la pipette pendant la dissection. Une fois décongelé, ajoutez 0,01 % de sulforhodamine B pour la coloration intracellulaire.

3. Enregistrements de patch clamp à partir de la préparation d’une tranche rétinienne

1. Préparation de l’enregistrement :
   1. Amorcez les tubes de perfusion avec le milieu d'Ames. Laissez passer toutes les bulles lors du remplissage du tube.
   2. Fabriquez des pipettes d’enregistrement à patch clamp avec un extracteur. Pour remplir une pipette avec la solution de pipette, trempez-la à l’arrière de la pipette pendant 1 minute jusqu’à ce que la pointe de la pipette soit remplie. Ensuite, remplissez ~1/3 de la pipette à l’aide d’une remplisseuse de micro-pipette. Rangez chaque pipette dans une boîte à pipette humide.
   3. Mettez sous tension l’équipement d’enregistrement par patch clamp, y compris l’ordinateur, l’amplificateur, la caméra du dispositif à couplage de charge (CCD) et le microscope.
2. Éteignez la lumière de la pièce. Placez une préparation de coupe rétinienne sur la chambre de la platine du microscope à l’aide d’une visionneuse infrarouge. Une fois qu’il est immobilisé, commencez la perfusion continue. Réglez la température de perfusion entre 33 et 37 °C.
3. Visualisez la surface de la tranche avec la caméra CCD. Concentrez-vous sur l’emplacement cible où résident les types de cellules cibles. Sélectionnez une cellule d’apparence saine pour l’enregistrement à l’aide d’un patch clamp (c’est-à-dire qu’elle doit avoir une surface lisse et une bonne forme de cellule).
4. Placez une pipette d’enregistrement dans un porte-pipette. Avancez la pipette jusqu’à la préparation de la tranche. Lorsqu’il est proche de la préparation de la tranche (~2 mm au-dessus), trouvez la pointe de la pipette avec le microscope. Une fois que la pointe de la pipette est visible au microscope, déplacez la pointe vers le bas vers la cellule cible.
5. Réglez l’amplificateur. Ajustez la pipette à 0 mV/0 pA (mise à zéro) et démarrez une impulsion électrique continue de ~5 mV à ~10 Hz. Vérifiez la résistance de la pipette ; la résistance idéale se situe entre 5 et 10 MΩ pour la plupart des neurones rétiniens.
6. Commencez à souffler à partir de la pointe. À l’aide d’un embout buccal ou d’une seringue, appliquez une pression positive lorsque la pipette plonge dans la solution du bain. Soufflez continuellement la solution interne jusqu’à ce que la pointe soit à la surface de la cellule cible.
   1. Lorsque la pression positive fait une petite fossette à la surface de la cellule, avancez légèrement l’extrémité et arrêtez de souffler. Vérifiez la résistance de la pipette, qui doit augmenter. S’il augmente continuellement, laissez-le et surveillez la résistance jusqu’à ce qu’il atteigne >1 GΩ (gigaseal). Si la résistance n’augmente pas spontanément, appliquez doucement une pression négative jusqu’à ce qu’elle devienne un gigaseal.
7. Une fois le gigaseal obtenu, modifiez le potentiel de maintien à -70 mV. Ensuite, appliquez par intermittence une pression négative pour rompre la membrane à l’intérieur de la pointe de la pipette. Lorsque la configuration de la cellule entière est réalisée, la résistance de la pipette peut être comprise entre 500 MΩ et 1 GΩ, et le courant capacitif est visible. Parfois, des courants postsynaptiques spontanés peuvent être observés.
8. Enregistrez la relation courant-tension (I-V) de -80 à +40 mV. Différents types de canaux voltage-dépendants sont activés en fonction du type de cellule.
9. Enregistrez les courants ou tensions synaptiques évoqués par la lumière.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris (28-60 jours, mâle)	Laboratoire Jackson	Souche C57BL/6J
Poudre moyenne d'Ames	sigma	A1420	Excellente
Visionneuse infrarouge	Optique Night Owl	NOBG1	Il montre une vue lumineuse. La mise au point de petits objets est un problème.
Lunettes de poche infrarouges	B.E. Meyers	Lunette de poche OWL Gen 3 NV	Excellente vue
Extracteur	Sutter	P-1000	Excellente. Fabriquez des pipettes de taille constante.
Boîte noire	pélican	Boîte noire	Excellente
Système de pince de patch	Scientifica	Tranche d’écran 2000	Excellente configuration. La plupart des composants clés sont inclus dans un seul package. Les micromanipulateurs sont excellents.
amplificateur	Dispositifs moléculaires	multiclamp 700B	Contrôle excellent et facile.
Acquisition de logiciels	Dispositifs moléculaires	Logiciel pClamp	Contrôle excellent et facile.
source lumineuse (LED)	LED froide	Système pE-2 à 4 canaux	Excellente
Caméra CCD	Q-imagerie	Retiga 2000	Excellente
Cage de Faraday	fait main