Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Perfusion transcardique
- Suspendez une seringue d’une capacité de 60 ml comme réservoir pour la solution de coupe de saccharose à environ 18 pouces au-dessus de la paillasse (p. ex., à l’aide d’une pince pivotante à trois dents sur un poteau vertical). Fixez le tube au fond du réservoir, passez-le à travers une pince à rouleau et connectez l’autre extrémité du tube à une aiguille propre de 20 G.
- Remplissez le réservoir de 60 mL avec environ 30 mL de solution de saccharose réfrigérée et dirigez une conduite de carbogène dans le réservoir de saccharose pour faire bouillir continuellement le perfusat.
note: Assurez-vous que le saccharose s’écoule à travers le tube et l’aiguille sans bulles piégées. Le débit doit être juste assez rapide pour avoir un flux régulier et continu de saccharose qui s’écoule de l’aiguille.
- À l’aide d’un mélangeur, écrasez et mélangez le saccharose congelé en une bouillie glacée et utilisez la grande spatule/cuillère pour répartir la bouillie.
- Placez une petite quantité de boue de saccharose sur les bords du couvercle de la boîte de Pétri en verre. Ajoutez une petite quantité de bouillie de saccharose au fond de la boîte de Pétri.
- Ajoutez environ 20 à 30 ml de suspension de saccharose dans le réservoir de liquide de perfusion, en la mélangeant bien avec les 30 ml de saccharose liquide réfrigéré jusqu’à ce que le réservoir contienne un mélange de saccharose très froid, principalement liquide, avec un reste de solution congelée.
- Placez la souris dans une chambre reliée à un vaporisateur d’isoflurane. Avec un débit d’oxygène d’environ 2 L/min, tournez le cadran du vaporisateur pour délivrer de l’isoflurane à une concentration de 5 % et démarrez une minuterie.
note: Gardez cette minuterie allumée tout au long du tranchage pour évaluer la rapidité avec laquelle les tranches sont obtenues. La procédure doit être effectuée le plus rapidement possible, de sorte que le tranchage soit terminé et que les tissus se rétablissent dans la chambre d’interface dans les 15 à 20 minutes suivant l’entrée de l’animal dans la chambre d’isoflurane. Surveillez la souris pour vous assurer qu’un état d’anesthésie profonde est atteint. Après un minimum de 5 minutes, la souris doit être profondément anesthésiée et ne pas répondre aux pincements des orteils.
- Immédiatement avant de retirer la souris de la chambre d’isoflurane, remplissez le couvercle de la boîte de Pétri avec une solution de saccharose réfrigérée à une profondeur d’environ 3 à 5 mm et remplissez le fond de la boîte de Pétri avec une solution de saccharose réfrigérée à une profondeur d’environ 1,0 cm.
- Transférez rapidement la souris sur le tampon absorbant gauche et utilisez les 3 morceaux de ruban adhésif pour fixer les membres antérieurs et la queue. Effectuez un pincement de l’orteil des membres postérieurs pour vous assurer que la souris ne répond pas avant de pratiquer toute incision. À l’aide de la grande pince à tissus et des ciseaux chirurgicaux, tentez la peau et faites une incision dans le sens de la longueur du bas du sternum au haut de la poitrine. À l’aide de la pince, tirez sur le sternum et utilisez les ciseaux pour couper le diaphragme.
note: Le positionnement initial de la souris et les premières incisions pour sectionner le diaphragme doivent être effectués le plus rapidement possible afin de s’assurer que la souris ne reprenne pas conscience. Pour assurer une profondeur d’anesthésie adéquate tout au long de la procédure, un cône nasal peut être placé sur la souris pour délivrer de l’isoflurane pendant la perfusion.
- Utilisez les ciseaux pour couper la cage thoracique de chaque côté, en coupant d’un seul grand mouvement vers le point où le membre antérieur rencontre le corps. À l’aide de la pince, balancez l’avant de la cage thoracique vers l’extérieur et vers la tête, puis retirez-la complètement avec une coupe horizontale à l’aide de grands ciseaux. Maintenez le cœur en place à l’aide de la grande pince et insérez l’aiguille de perfusion de 20 G dans le ventricule gauche. Une fois l’aiguille correctement positionnée, le côté gauche du cœur devrait rapidement pâlir lorsque la solution de saccharose réfrigérée remplit le ventricule.
- Utilisez les petits ciseaux de dissecteur pour couper dans l’oreillette droite et permettre au sang de s’écouler hors du système circulatoire. Si les incisions sont effectuées correctement, il devrait y avoir des dommages minimes au cœur et il devrait continuer à pomper tout au long de la perfusion.
note: Des morceaux de papier de soie enroulés peuvent être utilisés pour évacuer le sang et la solution de saccharose du cœur et maintenir la visibilité de l’aiguille de perfusion pendant la procédure.
- Assurez-vous que l’aiguille de perfusion reste en place et ne tombe pas du ventricule gauche. Avec un débit et un placement appropriés, le foie commencera à pâlir jusqu’à une couleur beige clair avec 20 à 30 s.
- Après 30 à 45 s, utilisez les grands ciseaux pour décapiter la souris. En tenant la tête dans la main gauche, poussez ou retirez la peau du crâne. Chez un animal bien perfusé, le crâne doit être très pâle et le cerveau doit apparaître d’une couleur rose très clair (approchant du blanc) à travers le crâne sans vaisseaux sanguins clairement visibles.
2. Extraire le cerveau et couper des tranches
- À l’aide des petits ciseaux de Bonn, faites deux entailles latérales à travers le crâne vers la ligne médiane à l’avant du crâne, près des yeux. Faites deux entailles supplémentaires de chaque côté de la base du crâne.
- Transférez la tête au fond de la boîte de Pétri en verre où elle doit être principalement immergée dans une solution de saccharose réfrigérée. Utilisez les petits ciseaux de Bonn pour couper la ligne médiane sur toute la longueur du crâne, en tirant vers le haut avec les ciseaux pour minimiser les dommages au tissu cérébral sous-jacent. À l’aide de la petite pince à tissus, saisissez fermement chaque côté du crâne et balancez-le vers le haut et loin du cerveau, comme si vous ouvriez un livre.
- Utilisez les doigts de la main gauche pour maintenir les rabats du crâne ouverts et insérez la microspatule sous le cerveau près des bulbes olfactifs. Retournez le cerveau hors du crâne dans le saccharose et utilisez la microspatule pour sectionner le tronc cérébral. Lavez le cerveau pour éliminer tout résidu de sang, de fourrure ou d’autres tissus.
- Utilisez la grande spatule/cuillère pour transférer le cerveau sur le couvercle de la boîte de Pétri en verre. Avec l’autre moitié de la lame de rasoir à double tranchant préalablement mise de côté, faites deux coupes coronales pour retirer d’abord le cervelet, puis la partie la plus antérieure du cerveau, y compris les bulbes olfactifs (Figure 1).
- Appliquez de l’adhésif cyanoacrylate sur la rampe de gélose. Placez très brièvement le cerveau sur un morceau de papier filtre sec à l’aide de la grande pince à tissus, puis transférez-le immédiatement sur la rampe de gélose, en plaçant la surface ventrale du cerveau sur l’adhésif.
note: Pour les tranches de l’hippocampe intermédiaire, le cerveau doit être orienté avec l’antérieur tourné vers le haut de la pente de la rampe et l’arrière plus près de la lame. Pour les tranches de l’hippocampe ventral, orientez le cerveau avec l’extrémité antérieure pointée vers le bas de la pente de la rampe, avec l’extrémité postérieure en haut de la rampe, plus loin de la lame. Dans les deux cas, le cerveau doit être positionné au sommet de la rampe, de sorte que la surface coronaire du cerveau entre en contact avec le bloc de dos gélosé (Figure 1).
- Placez la plate-forme de tranchage avec la gélose et la cervelle dans la chambre de tranchage du microtome et immergez-la complètement avec une solution de saccharose réfrigérée. Utilisez la grande spatule/cuillère pour transférer un peu de boue de saccharose dans la chambre, en remuant pour faire fondre le saccharose congelé et abaisser rapidement la température du mélange à ~1–2 °C.
note: Surveillez la jauge de température tout au long du tranchage. Si la solution de saccharose se réchauffe au-dessus de 3 °C, ajoutez plus de boue et mélangez pour faire baisser la température.
- Coupez des tranches d’une épaisseur de 450 μm avec la vitesse du microtome réglée sur 0,07 mm/s. Au fur et à mesure que chaque tranche est libérée, à l’aide d’une petite pince à tissus et d’un scalpel bien aiguisé, séparez d’abord les deux hémisphères, puis coupez les tissus jusqu’à ce que la tranche se compose principalement des régions de l’hippocampe et du parahippocampe (Figure 1).
- À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférez les tranches individuellement dans la chambre de récupération de l’interface, en veillant à ce qu’elles soient positionnées à l’interface de l’ACSF et de l’air, avec seulement un mince ménisque de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) recouvrant les tranches. Fermez hermétiquement le couvercle de la chambre et laissez les tranches récupérer à 32 °C pendant 30 min.
- Après la récupération initiale à 32 °C, sortez la chambre de récupération d’interface du bain-marie et placez-la sur un agitateur réglé à une vitesse lente de sorte que la barre d’agitation magnétique favorise la circulation de l’ACSF à l’intérieur de la chambre. Laissez-le refroidir progressivement à température ambiante au fur et à mesure que les tranches se rétablissent pendant 90 minutes supplémentaires. Assurez-vous que la chambre de récupération est continuellement remplie de carbogène et ne laissez pas de grosses bulles se coincer sous les tranches.
3. Effectuer des enregistrements de potentiel de champ local (LFP) de l’activité spontanée
- Préparez-vous aux enregistrements LFP en allumant tout l’équipement nécessaire, y compris l’ordinateur exécutant le logiciel d’acquisition, le moniteur connecté à l’ordinateur, les stimulateurs, le micromanipulateur, le régulateur de température, la source lumineuse du microscope, la caméra fixée au microscope, l’amplificateur de microélectrodes, le numériseur et la pompe péristaltique. Si vous utilisez un système d’aspiration central, ouvrez la vanne murale pour préparer la conduite de vide qui éliminera l’ACSF de la chambre d’enregistrement.
- Remplissez le réservoir chauffé d’ACSF, puis placez une extrémité du tube dans le bécher de 400 ml contenant l’ACSF bouillonnant. Allumez la pompe péristaltique pour diriger l’ACSF du bécher de 400 ml vers le réservoir chauffé, et du réservoir vers la chambre d’enregistrement. Tapotez ou pincez le tube pour libérer les bulles piégées.
- Ajustez la pompe péristaltique pour vous assurer que le débit ACSF à travers la chambre d’enregistrement est rapide (~ 8 à 10 ml/min). À l’aide d’une sonde de température, assurez-vous que l’ACSF est à 32 °C au centre de la chambre d’enregistrement.
note: Si l’ACSF est acheminé vers la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pompe péristaltique, un débit élevé peut entraîner une fluctuation significative du débit. Des débits constants peuvent être obtenus à l’aide d’un simple amortisseur de pulsations composé d’une série de seringues vides intégrées dans la tubulure (figure 2).
- Préparez des pipettes de stimulation et d’enregistrement à partir de capillaires en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de filament chauffé. Le protocole d’extraction doit être configuré pour produire des pipettes d’une résistance de 2 à 3 MOhm pour la stimulation ou des électrodes d’enregistrement de potentiel de champ local.
- Remplissez les pipettes de stimulation avec des pipettes 1 M NaCl et LFP avec ACSF.
- Clampez brièvement le tube et éteignez la pompe pour interrompre le débit d’ACSF. Transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pince fine pour saisir un coin du papier de l’objectif sur lequel la tranche repose - la tranche collera au papier de l’objectif. Placez le papier de l’objectif et coupez-le dans la chambre d’enregistrement avec la tranche vers le bas, puis « décollez » le papier de l’objectif en laissant la tranche immergée dans la chambre d’enregistrement. Fixez la tranche à l’aide d’un /> harp.
note: Les harpes peuvent être achetées préfabriquées ou fabriquées en laboratoire à l’aide d’un morceau en forme de U en acier inoxydable ou de platine et d’un fin filament de nylon.
- Placez une pipette de stimulation remplie de NaCl dans le micromanipulateur manuel et avancez lentement la pointe de la pipette à la surface de la tranche (par exemple, dans la couche radiale) à un angle d’environ 30 à 45°. Une fois que la pointe de la pipette pénètre dans le tissu, avancez lentement la pipette vers l’avant et abstenez-vous de grands mouvements dans le sens latéral ou vertical qui pourraient endommager inutilement les axones à l’intérieur de la tranche. Placez l’extrémité de la pipette à au moins 50 à 100 μm de profondeur dans la tranche pour éviter les cellules proches de la surface qui ont été endommagées lors du tranchage.
- Placez une pipette LFP remplie d’ACSF dans le support de pipette fixé au micromanipulateur motorisé. Appliquez une très légère pression positive en utilisant la pression de la bouche ou une seringue de 1 mL reliée au porte-pipette par une valve à robinet d’arrêt et une courte longueur de tubulure au porte-pipette.
note: Positionnez les pipettes LFP à l’intérieur de la tranche afin d’enregistrer les signaux d’intérêt : dans le cas d’ondulations aiguës, une pipette LFP doit être placée dans la couche pyramidale (SP) et une seconde pipette dans la couche radiale (SR). Cette configuration permet d’enregistrer simultanément l’onde aiguë négative dans le SR et l’oscillation ondulatoire à haute fréquence dans le SP (Figure 3).
- À l’aide du micromanipulateur, avancez lentement l’extrémité de la pipette LFP dans la région d’intérêt (par exemple, la couche de cellules pyramidales CA1) à un angle d’environ 30 à 45°. Placez l’extrémité de la pipette à au moins 50 à 100 μm de profondeur dans la tranche pour éviter les cellules proches de la surface qui ont été endommagées lors du tranchage. Tout en faisant avancer la pipette LFP, délivrez en permanence une petite impulsion de test de tension à l’aide du logiciel d’acquisition et surveillez une augmentation soudaine de la résistance de l’électrode. Cela peut indiquer que la pipette a été bouchée ou pressée contre une cellule.
- Une fois la pipette LFP positionnée dans la région d’intérêt, relâchez délicatement la pression positive en ouvrant la valve sur le tube fixé au porte-pipette.
- Pour enregistrer simultanément le LFP dans un deuxième emplacement, répétez les étapes 6.8 à 6.10 avec une deuxième pipette et un micromanipulateur.
- Utilisez l’amplificateur de microélectrode dans la configuration de la pince de courant pour enregistrer l’activité spontanée dans le potentiel de champ local après avoir utilisé la fonction d’équilibre en pont dans le logiciel d’acquisition pour corriger la résistance en série de la pipette. Les ondulations spontanées à ondes aiguës (SWR) apparaîtront comme des déviations positives du potentiel extracellulaire de la couche SP (Figure 3).
- Afin d’enregistrer les potentiels de champ évoqués, utilisez les stimulateurs connectés au numériseur pour délivrer une courte impulsion de tension carrée (200 us) à travers la pipette de stimulation remplie de NaCl. Ajustez le cadran de tension de stimulation pour évoquer une gamme d’amplitudes de réponse.
