Enregistrement du potentiel de champ local dans des coupes de cortex hippocampique-entorhinal de souris

Résumé

Source : Whitebirch, A. C. Découpage aigu du cerveau de souris pour étudier l’activité spontanée du réseau hippocampique. J. Vis. Exp. (2020)

La vidéo montre une procédure d’enregistrement du potentiel de champ local (LFP) dans des coupes de cortex hippocampique-entorhinal de souris. La stimulation électrique est fournie au niveau de la strate radiale CA3 de l’hippocampe, ce qui provoque des modifications du potentiel postsynaptique au niveau de la strate pyramidale CA1. La variation combinée du potentiel membranaire des neurones CA1, appelée potentiel de champ local, est enregistrée.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Perfusion transcardique

1. Suspendez une seringue d’une capacité de 60 ml comme réservoir pour la solution de coupe de saccharose à environ 18 pouces au-dessus de la paillasse (p. ex., à l’aide d’une pince pivotante à trois dents sur un poteau vertical). Fixez le tube au fond du réservoir, passez-le à travers une pince à rouleau et connectez l’autre extrémité du tube à une aiguille propre de 20 G.
2. Remplissez le réservoir de 60 mL avec environ 30 mL de solution de saccharose réfrigérée et dirigez une conduite de carbogène dans le réservoir de saccharose pour faire bouillir continuellement le perfusat.
   note: Assurez-vous que le saccharose s’écoule à travers le tube et l’aiguille sans bulles piégées. Le débit doit être juste assez rapide pour avoir un flux régulier et continu de saccharose qui s’écoule de l’aiguille.
3. À l’aide d’un mélangeur, écrasez et mélangez le saccharose congelé en une bouillie glacée et utilisez la grande spatule/cuillère pour répartir la bouillie.
   1. Placez une petite quantité de boue de saccharose sur les bords du couvercle de la boîte de Pétri en verre. Ajoutez une petite quantité de bouillie de saccharose au fond de la boîte de Pétri.
   2. Ajoutez environ 20 à 30 ml de suspension de saccharose dans le réservoir de liquide de perfusion, en la mélangeant bien avec les 30 ml de saccharose liquide réfrigéré jusqu’à ce que le réservoir contienne un mélange de saccharose très froid, principalement liquide, avec un reste de solution congelée.
4. Placez la souris dans une chambre reliée à un vaporisateur d’isoflurane. Avec un débit d’oxygène d’environ 2 L/min, tournez le cadran du vaporisateur pour délivrer de l’isoflurane à une concentration de 5 % et démarrez une minuterie.
   note: Gardez cette minuterie allumée tout au long du tranchage pour évaluer la rapidité avec laquelle les tranches sont obtenues. La procédure doit être effectuée le plus rapidement possible, de sorte que le tranchage soit terminé et que les tissus se rétablissent dans la chambre d’interface dans les 15 à 20 minutes suivant l’entrée de l’animal dans la chambre d’isoflurane. Surveillez la souris pour vous assurer qu’un état d’anesthésie profonde est atteint. Après un minimum de 5 minutes, la souris doit être profondément anesthésiée et ne pas répondre aux pincements des orteils.
5. Immédiatement avant de retirer la souris de la chambre d’isoflurane, remplissez le couvercle de la boîte de Pétri avec une solution de saccharose réfrigérée à une profondeur d’environ 3 à 5 mm et remplissez le fond de la boîte de Pétri avec une solution de saccharose réfrigérée à une profondeur d’environ 1,0 cm.
6. Transférez rapidement la souris sur le tampon absorbant gauche et utilisez les 3 morceaux de ruban adhésif pour fixer les membres antérieurs et la queue. Effectuez un pincement de l’orteil des membres postérieurs pour vous assurer que la souris ne répond pas avant de pratiquer toute incision. À l’aide de la grande pince à tissus et des ciseaux chirurgicaux, tentez la peau et faites une incision dans le sens de la longueur du bas du sternum au haut de la poitrine. À l’aide de la pince, tirez sur le sternum et utilisez les ciseaux pour couper le diaphragme.
   note: Le positionnement initial de la souris et les premières incisions pour sectionner le diaphragme doivent être effectués le plus rapidement possible afin de s’assurer que la souris ne reprenne pas conscience. Pour assurer une profondeur d’anesthésie adéquate tout au long de la procédure, un cône nasal peut être placé sur la souris pour délivrer de l’isoflurane pendant la perfusion.
7. Utilisez les ciseaux pour couper la cage thoracique de chaque côté, en coupant d’un seul grand mouvement vers le point où le membre antérieur rencontre le corps. À l’aide de la pince, balancez l’avant de la cage thoracique vers l’extérieur et vers la tête, puis retirez-la complètement avec une coupe horizontale à l’aide de grands ciseaux. Maintenez le cœur en place à l’aide de la grande pince et insérez l’aiguille de perfusion de 20 G dans le ventricule gauche. Une fois l’aiguille correctement positionnée, le côté gauche du cœur devrait rapidement pâlir lorsque la solution de saccharose réfrigérée remplit le ventricule.
8. Utilisez les petits ciseaux de dissecteur pour couper dans l’oreillette droite et permettre au sang de s’écouler hors du système circulatoire. Si les incisions sont effectuées correctement, il devrait y avoir des dommages minimes au cœur et il devrait continuer à pomper tout au long de la perfusion.
   note: Des morceaux de papier de soie enroulés peuvent être utilisés pour évacuer le sang et la solution de saccharose du cœur et maintenir la visibilité de l’aiguille de perfusion pendant la procédure.
9. Assurez-vous que l’aiguille de perfusion reste en place et ne tombe pas du ventricule gauche. Avec un débit et un placement appropriés, le foie commencera à pâlir jusqu’à une couleur beige clair avec 20 à 30 s.
10. Après 30 à 45 s, utilisez les grands ciseaux pour décapiter la souris. En tenant la tête dans la main gauche, poussez ou retirez la peau du crâne. Chez un animal bien perfusé, le crâne doit être très pâle et le cerveau doit apparaître d’une couleur rose très clair (approchant du blanc) à travers le crâne sans vaisseaux sanguins clairement visibles.

2. Extraire le cerveau et couper des tranches

1. À l’aide des petits ciseaux de Bonn, faites deux entailles latérales à travers le crâne vers la ligne médiane à l’avant du crâne, près des yeux. Faites deux entailles supplémentaires de chaque côté de la base du crâne.
2. Transférez la tête au fond de la boîte de Pétri en verre où elle doit être principalement immergée dans une solution de saccharose réfrigérée. Utilisez les petits ciseaux de Bonn pour couper la ligne médiane sur toute la longueur du crâne, en tirant vers le haut avec les ciseaux pour minimiser les dommages au tissu cérébral sous-jacent. À l’aide de la petite pince à tissus, saisissez fermement chaque côté du crâne et balancez-le vers le haut et loin du cerveau, comme si vous ouvriez un livre.
3. Utilisez les doigts de la main gauche pour maintenir les rabats du crâne ouverts et insérez la microspatule sous le cerveau près des bulbes olfactifs. Retournez le cerveau hors du crâne dans le saccharose et utilisez la microspatule pour sectionner le tronc cérébral. Lavez le cerveau pour éliminer tout résidu de sang, de fourrure ou d’autres tissus.
4. Utilisez la grande spatule/cuillère pour transférer le cerveau sur le couvercle de la boîte de Pétri en verre. Avec l’autre moitié de la lame de rasoir à double tranchant préalablement mise de côté, faites deux coupes coronales pour retirer d’abord le cervelet, puis la partie la plus antérieure du cerveau, y compris les bulbes olfactifs (Figure 1).
5. Appliquez de l’adhésif cyanoacrylate sur la rampe de gélose. Placez très brièvement le cerveau sur un morceau de papier filtre sec à l’aide de la grande pince à tissus, puis transférez-le immédiatement sur la rampe de gélose, en plaçant la surface ventrale du cerveau sur l’adhésif.
   note: Pour les tranches de l’hippocampe intermédiaire, le cerveau doit être orienté avec l’antérieur tourné vers le haut de la pente de la rampe et l’arrière plus près de la lame. Pour les tranches de l’hippocampe ventral, orientez le cerveau avec l’extrémité antérieure pointée vers le bas de la pente de la rampe, avec l’extrémité postérieure en haut de la rampe, plus loin de la lame. Dans les deux cas, le cerveau doit être positionné au sommet de la rampe, de sorte que la surface coronaire du cerveau entre en contact avec le bloc de dos gélosé (Figure 1).
6. Placez la plate-forme de tranchage avec la gélose et la cervelle dans la chambre de tranchage du microtome et immergez-la complètement avec une solution de saccharose réfrigérée. Utilisez la grande spatule/cuillère pour transférer un peu de boue de saccharose dans la chambre, en remuant pour faire fondre le saccharose congelé et abaisser rapidement la température du mélange à ~1–2 °C.
   note: Surveillez la jauge de température tout au long du tranchage. Si la solution de saccharose se réchauffe au-dessus de 3 °C, ajoutez plus de boue et mélangez pour faire baisser la température.
7. Coupez des tranches d’une épaisseur de 450 μm avec la vitesse du microtome réglée sur 0,07 mm/s. Au fur et à mesure que chaque tranche est libérée, à l’aide d’une petite pince à tissus et d’un scalpel bien aiguisé, séparez d’abord les deux hémisphères, puis coupez les tissus jusqu’à ce que la tranche se compose principalement des régions de l’hippocampe et du parahippocampe (Figure 1).
8. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférez les tranches individuellement dans la chambre de récupération de l’interface, en veillant à ce qu’elles soient positionnées à l’interface de l’ACSF et de l’air, avec seulement un mince ménisque de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) recouvrant les tranches. Fermez hermétiquement le couvercle de la chambre et laissez les tranches récupérer à 32 °C pendant 30 min.
9. Après la récupération initiale à 32 °C, sortez la chambre de récupération d’interface du bain-marie et placez-la sur un agitateur réglé à une vitesse lente de sorte que la barre d’agitation magnétique favorise la circulation de l’ACSF à l’intérieur de la chambre. Laissez-le refroidir progressivement à température ambiante au fur et à mesure que les tranches se rétablissent pendant 90 minutes supplémentaires. Assurez-vous que la chambre de récupération est continuellement remplie de carbogène et ne laissez pas de grosses bulles se coincer sous les tranches.

3. Effectuer des enregistrements de potentiel de champ local (LFP) de l’activité spontanée

1. Préparez-vous aux enregistrements LFP en allumant tout l’équipement nécessaire, y compris l’ordinateur exécutant le logiciel d’acquisition, le moniteur connecté à l’ordinateur, les stimulateurs, le micromanipulateur, le régulateur de température, la source lumineuse du microscope, la caméra fixée au microscope, l’amplificateur de microélectrodes, le numériseur et la pompe péristaltique. Si vous utilisez un système d’aspiration central, ouvrez la vanne murale pour préparer la conduite de vide qui éliminera l’ACSF de la chambre d’enregistrement.
2. Remplissez le réservoir chauffé d’ACSF, puis placez une extrémité du tube dans le bécher de 400 ml contenant l’ACSF bouillonnant. Allumez la pompe péristaltique pour diriger l’ACSF du bécher de 400 ml vers le réservoir chauffé, et du réservoir vers la chambre d’enregistrement. Tapotez ou pincez le tube pour libérer les bulles piégées.
3. Ajustez la pompe péristaltique pour vous assurer que le débit ACSF à travers la chambre d’enregistrement est rapide (~ 8 à 10 ml/min). À l’aide d’une sonde de température, assurez-vous que l’ACSF est à 32 °C au centre de la chambre d’enregistrement.
   note: Si l’ACSF est acheminé vers la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pompe péristaltique, un débit élevé peut entraîner une fluctuation significative du débit. Des débits constants peuvent être obtenus à l’aide d’un simple amortisseur de pulsations composé d’une série de seringues vides intégrées dans la tubulure (figure 2).
4. Préparez des pipettes de stimulation et d’enregistrement à partir de capillaires en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de filament chauffé. Le protocole d’extraction doit être configuré pour produire des pipettes d’une résistance de 2 à 3 MOhm pour la stimulation ou des électrodes d’enregistrement de potentiel de champ local.
5. Remplissez les pipettes de stimulation avec des pipettes 1 M NaCl et LFP avec ACSF.
6. Clampez brièvement le tube et éteignez la pompe pour interrompre le débit d’ACSF. Transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pince fine pour saisir un coin du papier de l’objectif sur lequel la tranche repose - la tranche collera au papier de l’objectif. Placez le papier de l’objectif et coupez-le dans la chambre d’enregistrement avec la tranche vers le bas, puis « décollez » le papier de l’objectif en laissant la tranche immergée dans la chambre d’enregistrement. Fixez la tranche à l’aide d’un /> harp.
   note: Les harpes peuvent être achetées préfabriquées ou fabriquées en laboratoire à l’aide d’un morceau en forme de U en acier inoxydable ou de platine et d’un fin filament de nylon.
7. Placez une pipette de stimulation remplie de NaCl dans le micromanipulateur manuel et avancez lentement la pointe de la pipette à la surface de la tranche (par exemple, dans la couche radiale) à un angle d’environ 30 à 45°. Une fois que la pointe de la pipette pénètre dans le tissu, avancez lentement la pipette vers l’avant et abstenez-vous de grands mouvements dans le sens latéral ou vertical qui pourraient endommager inutilement les axones à l’intérieur de la tranche. Placez l’extrémité de la pipette à au moins 50 à 100 μm de profondeur dans la tranche pour éviter les cellules proches de la surface qui ont été endommagées lors du tranchage.
8. Placez une pipette LFP remplie d’ACSF dans le support de pipette fixé au micromanipulateur motorisé. Appliquez une très légère pression positive en utilisant la pression de la bouche ou une seringue de 1 mL reliée au porte-pipette par une valve à robinet d’arrêt et une courte longueur de tubulure au porte-pipette.
   note: Positionnez les pipettes LFP à l’intérieur de la tranche afin d’enregistrer les signaux d’intérêt : dans le cas d’ondulations aiguës, une pipette LFP doit être placée dans la couche pyramidale (SP) et une seconde pipette dans la couche radiale (SR). Cette configuration permet d’enregistrer simultanément l’onde aiguë négative dans le SR et l’oscillation ondulatoire à haute fréquence dans le SP (Figure 3).
9. À l’aide du micromanipulateur, avancez lentement l’extrémité de la pipette LFP dans la région d’intérêt (par exemple, la couche de cellules pyramidales CA1) à un angle d’environ 30 à 45°. Placez l’extrémité de la pipette à au moins 50 à 100 μm de profondeur dans la tranche pour éviter les cellules proches de la surface qui ont été endommagées lors du tranchage. Tout en faisant avancer la pipette LFP, délivrez en permanence une petite impulsion de test de tension à l’aide du logiciel d’acquisition et surveillez une augmentation soudaine de la résistance de l’électrode. Cela peut indiquer que la pipette a été bouchée ou pressée contre une cellule.
10. Une fois la pipette LFP positionnée dans la région d’intérêt, relâchez délicatement la pression positive en ouvrant la valve sur le tube fixé au porte-pipette.
11. Pour enregistrer simultanément le LFP dans un deuxième emplacement, répétez les étapes 6.8 à 6.10 avec une deuxième pipette et un micromanipulateur.
12. Utilisez l’amplificateur de microélectrode dans la configuration de la pince de courant pour enregistrer l’activité spontanée dans le potentiel de champ local après avoir utilisé la fonction d’équilibre en pont dans le logiciel d’acquisition pour corriger la résistance en série de la pipette. Les ondulations spontanées à ondes aiguës (SWR) apparaîtront comme des déviations positives du potentiel extracellulaire de la couche SP (Figure 3).
13. Afin d’enregistrer les potentiels de champ évoqués, utilisez les stimulateurs connectés au numériseur pour délivrer une courte impulsion de tension carrée (200 us) à travers la pipette de stimulation remplie de NaCl. Ajustez le cadran de tension de stimulation pour évoquer une gamme d’amplitudes de réponse.

Résultats

Figure 1 : Préparation de coupes horizontales de cortex hippocampique-entorhinal (HEC). (A)(i) Après avoir extrait le cerveau, effectuez deux coupes coronales avec une lame de rasoir pour enlever les parties postérieure et antérieure du cerveau. (ii) La rampe de gélose est formée de deux parties inclinées collées à la plate-forme de tranchage ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Support d’incubation de tranche de cerveau aiguë	Échange d’impression 3D NIH	Réf. 3DPX-001623	Conçu par ChiaMing Lee, disponible chez https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Sel de magnésium adénosine 5′-triphosphate	Sigma Aldrich	A9187-500MG
Granulés moulus Ag-Cl	Warner	64-1309, (E205)
agar-agar	Becton, Dickinson	214530-500g
acide ascorbique	Alfa Aesar	Référence 36237
bécher (250 mL)	Kimax	14000 à 250
bécher (400 mL)	Kimax	14000 à 400
Biocytine	Sigma Aldrich	Réf. B4261
mixeur	Oster	BRLY07-B00-NP0
Ciseaux Bonn, petits	becton, Dickinson	Référence 14184-09
Capillaires en verre borosilicaté avec filament (D.E. 1,5 mm, D.I. 0,86 mm, longueur 10 cm)	Instruments Sutter	BF150-86-10HP	Les capillaires polis au feu sont préférables.
solution de chlorure de calcium (1 M)	G-Biosciences	Réf. R040
caméra	Olympe	OLY-150
Carbogen comprimé (95 % d’oxygène / 5 % de dioxyde de carbone)	Gaz à air	X02OX95C2003102
Oxygène comprimé	Gaz à air	OX 200
Stimulateur isolé à tension constante	Digitimer Ltd.	DS2A-Mk.II
lamelles de recouvrement (22x50 mm)	VWR	Référence 16004-314
Adhésif cyanoacrylate	Colle Krazy	KG925	Utilisez idéalement la forme au pinceau pour plus de précision
logiciel d’acquisition de données	Axographe	n/a	N’importe quel logiciel équivalent (par exemple pClamp) fonctionnerait.
Station de travail tour Dell Precision T1500	vallon	n/a	Le numéro de catalogue dépendra de l’ordinateur spécifique - n’importe quel ordinateur fonctionnera tant qu’il peut exécuter un logiciel d’acquisition d’électrophysiologie.
Digidata 1440A	Dispositifs moléculaires	Tél. : 1-2950-0367
Minuterie numérique	VWR	Référence 62344 à 641	Minuterie traçable à 4 canaux
Coussinets absorbants jetables	VWR	Référence 56616-018
Ciseaux Dissector	Outils scientifiques fins	Référence 14082-09
lames de rasoir à double tranchant	Personna	Réf. BP9020
Double régulateur de température automatique	Warner Instrument Corporation	TC-344B
Chambre d’enregistrement à double surface ou à flux laminaire optimisée	n/a	n/a	La chambre présentée dans ce protocole est fabriquée sur mesure. Un équivalent commercial serait le RC-27L de Warner Instruments.
rack d’équipement	Automatiser la science	FR-EQ70"	Un rack n’est pas strictement nécessaire mais utile pour organiser l’électrophysiologie
Éthylène glycol-bis(2-aminoethyiether)- Acide N,N,N',N'-tétraacétique (EGTA)	Sigma Aldrich	Référence 324626-25GM
papier filtre	Whatman	Référence 1004 070
échelle fine	Mettler Toledo	XS204DR
Extracteur de micropipette flamboyant/marron	Instruments Sutter	P-97
Boîte de Pétri en verre (100 x 15 mm)	Corning	Référence 3160-101
glucose	Fisher Scientific	D16-1
Sel de sodium 5′-triphosphate de guanosine	Sigma Aldrich	Référence G8877-250MG
seaux à glace	Sigma Aldrich	BAM168072002-1EA
Vaporisateur d’isoflurane	Services d’anesthésie générale	Tec 3
Ruban adhésif de laboratoire	Fisher Scientific	Référence 15-901-10R
Papier pour verres	Fisher Scientific	Référence 11-996
source lumineuse	Olympe	TH4-100
solution de chlorure de magnésium (1 M)	Qualité biologique	351-033-721EA
Barres d’agitation magnétiques	Fisher Scientific	Tél. : 14-513-56	Le numéro de catalogue dépendra de la taille de la barre d’agitation.
Micromanipulateur	Luigs et Neumann	SM-5
Micromanipulateur (manuel)	Scientifica	LBM-2000-00
microscope	Olympe	BX51WI
Microspatule	Outils scientifiques fins	Référence 10089-11
moniteur	vallon	2007FPb
Amplificateur à microélectrodes MultiClamp 700B	Dispositifs moléculaires	MULTICLAMP 700B	Le MultiClamp 700B doit inclure des étages supérieurs, des porte-pipettes et une cellule modèle.
Acide N-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-N'-(2-éthanesulfonique), (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375-25G
Aiguille (calibre 20, longueur de 1,5 po)	Becton, Dickinson	305176
Filament de nylon	YLI Wonder Fil invisible	Référence 212-15-004	taille 0.004. Ce chat. # provient de Amazon.com
Maille de nylon	Warner Instruments Corporation	Référence 64-0198
Pompe perstaltique	Appareil de Harvard	70-2027
Phosphocréatine di(tris) sel	Sigma Aldrich	Réf. P1937-1G
Porte-pipettes	Dispositifs moléculaires	1-HL-U
fil de platine	Précision mondiale	Réf. PT0203
filament d’acide polylactique (PLA)	Ultimaker	RAL 9010
chlorure de potassium	Sigma Aldrich	Réf. P3911-500G
gluconate de potassium	Sigma Aldrich	1550001-200MG
hydroxyde de potassium	Sigma Aldrich	60377-1KG
lames de rasoir	VWR	Référence 55411-050
Pince à rouleau	Instruments de précision mondiaux	Référence 14041
écaille	Mettler Toledo	PM2000
Manche de scalpel	Outils scientifiques fins	Référence 10004-13
Harpe en tranches	Warner	SHD-26GH/2
Bicarbonate de sodium	Fisher Chemical	S233-500
chlorure de sodium	Sigma Aldrich	S9888-1KG
phosphate de sodium monobasique anhydre	Fisher Chemical	S369-500
pyruvate de sodium	Fisher Chemical	Réf. BP356-100
spatule	VWR	Référence 82027-520
Spatule / cuillère, grande	VWR	Référence 470149-442
lames de scalpel stériles	plume	Référence 72044-10
agitateur / plaque chauffante	Corning	Référence 6795-220
robinets d’arrêt, 1 voie	Instruments de précision mondiaux	Référence 14054
robinets d’arrêt, 3 voies	Instruments de précision mondiaux	Référence 14036
saccharose	Acros Organics	AC177142500
Support pour pinces pivotantes	Fisher Scientific	14-679Q
Ciseaux chirurgicaux, tranchants/émoussés	Outils scientifiques fins	Référence 14001-12
seringue (1 mL)	Becton, Dickinson	309659
seringue (60 mL avec embout Luer-Lok)	Becton, Dickinson	309653
Pince à trois dents	Fisher Scientific	Tél. : 05-769-8Q
pinces à tissus, grandes	Outils scientifiques fins	Référence 11021-15
Pinces à tissus, petites	Outils scientifiques fins	Référence 11023-10
Pipettes de transfert	Fisher Scientific	13-711-7M
tubage	Tygon	E-3603	ID 1/16 pouce, OD 3/16 pouce
tubage	Tygon	R-3603	ID 1/8 pouce, OD 1/4 pouce
Graisse sous vide	Dow Corning	14-635-5D
microtome à lame vibrante	Leica	VT 1200S
Table d’amortissement des vibrations avec cage de Faraday	Micro-G / TMC-ametek	Référence 2536-516-4-30PE
Fiole jaugée (1 L)	Kimax	Référence : KIM-28014-1000
Fiole jaugée (2 L)	Pyrex	Référence 65640-2000
bain d’eau chaude	VWR	1209