Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Configuration de l’enregistrement électrophysiologique
- Fixez la peau de l’oreille externe de la souris (pavillon) à la base doublée de PDMS d’une chambre d’enregistrement avec de fines broches d’insectes sur les bords (~6-8 par oreille), en plaçant les nerfs nettoyés à la base de l’oreille près de deux électrodes d’aspiration - l’une pour l’enregistrement (pour prendre le nerf) et l’autre une électrode indifférente (pour fournir le signal neutre à un amplificateur différentiel).
- Pour l’électrode d’enregistrement, adaptez soigneusement l’ouverture et le diamètre intérieur de l’ouverture à l’épaisseur combinée des deux nerfs, afin qu’ils s’adaptent aussi bien que possible et sur une longueur aussi grande que possible.
- Aspirez doucement les nerfs dans l’électrode à l’aide d’une seringue de 2 ml fixée à l’autre extrémité à l’aide d’un tube en caoutchouc de silicone. Assurez-vous que les nerfs sont droits, non pliés ou doublés.
- Développez une résistance électrique/impédance élevée en utilisant une aspiration plus forte pour aspirer le tissu conjonctif ou le tissu adipeux pour former un bouchon qui scelle hermétiquement l’ouverture autour du nerf.
- Remplissez l’autre électrode (indifférente) de solution saline par aspiration si nécessaire (elle peut être remplie par capillarité).
- Placez des fils d’enregistrement identiques (argent ou platine) dans l’alésage interne des électrodes d’enregistrement pour entrer en contact avec la solution saline et le nerf (enregistrement) ou l’extrémité rétrécie et polie au feu (indifférente) de l’électrode. Chaque électrode est soudée individuellement à différents noyaux de câble blindé à deux conducteurs. Placez l’électrode du bain (pastille Ag/AgCl) dans le bain et mettez-la à la terre sur l’écran du câble bipolaire connecté aux électrodes d’enregistrement.
- Injectez l’activité électrique des deux électrodes dans les canaux séparés d’un amplificateur différentiel, d’un filtre (bande passante 0,2-2 kHz) et d’une vue sur un écran d’oscilloscope. Vérifiez que les niveaux de bruit électrique du canal A (enregistrement) et du canal B (indifférent) sont similaires. À ce stade, il peut ne pas être possible de voir les potentiels d’action spontanée normaux dans le canal A avant que les deux électrodes ne soient équilibrées.
- Corrigez les différences de bruit de fond entre les électrodes en augmentant l’impédance des électrodes d’enregistrement (canal A) ou indifférentes (canal B). Pour ce faire, aspirez le tissu conjonctif aréolaire (adipeux) dans l’une ou l’autre des électrodes et/ou appliquez une force d’aspiration plus importante sur la seringue de 50 ml.
- Une fois « équilibré » de cette manière, revenez à l'enregistrement différentiel (A-B) et recherchez les potentiels d'action spontanée (PA) dans la trace ou en caressant les poils au bord du pavillon. Si aucune activité (pic) n’est observée, vérifiez à nouveau l’ajustement serré du nerf dans l’électrode d’enregistrement et du tissu conjonctif aréolaire dans l’électrode indifférente - généralement, plus l’étanchéité est serrée (résistance élevée) et plus l’impédance dans les deux électrodes est égale, mieux c’est. Avec de la pratique, cela permettra d’obtenir un rapport signal/bruit de bonne qualité (>2:1).
- Enregistrez l’électroneurogramme via une interface de laboratoire et un logiciel d’électrophysiologie fonctionnant sur un ordinateur. Une sortie audio de dopage est très utile et peut être obtenue en alimentant le neurogramme par le biais d’un amplificateur audio et d’un haut-parleur audio associé. Ajustez le seuil pour qu'il soit juste au-dessus du bruit de base (identifié par l'absence de « sifflement » de bruit blanc).
- Pour augmenter l’accès du colorant styryle médicamenteux ou fluorescent aux extrémités lancéolées, décollez soigneusement la couche adipeuse sous-cutanée près du bord du pavillon, en ouvrant une fenêtre de ~5 mm x 5 mm, exposant le derme et la base des follicules (Figure 1A, B).
- Épingler un pli de ~1 mm de peau de l’oreille dégagée adipeuse au bord avant (au niveau de la fenêtre qui vient d’être produite, le cas échéant), en laissant un espace clair rempli de solution saline entre les couches de peau apposées. Caressez doucement les poils qui dépassent le long du bord plié à l'aide d'une goupille ou d'une pince fine mise à la terre, sans toucher la peau, pour localiser la zone de sortie AP maximale sur l'oscilloscope et les « clics » et « pops » distinctifs dans la sortie audio.
2. Enregistrement des potentiels d’action évoqués par stimulus
- Positionnez la sonde de stimulation mécanique – un verre borosilicate de 10 cm poli au feu fixé à un actionneur piézoélectrique en céramique – de manière à ce que le mouvement soit parallèle au pli de la peau. Placez la pointe à environ 0,5-1 mm du pli cutané, de sorte qu’elle touche les poils mais pas la peau. Vérifiez l’efficacité de la stimulation en déplaçant lentement la pointe de la sonde manuellement pour dévier les poils et observer/écouter les pointes.
- Utilisez le logiciel pour piloter la stimulation mécanique de 1 à 3 cheveux (par exemple 3 secondes à 5 Hz sinusoïdes, toutes les 10 secondes ; déplacement de la sonde 200-500 μm) et enregistrez les réponses évoquées par la stimulation dans les nerfs.
- Donnez plusieurs trains de stimulation mécanique identiques à 10 secondes d’intervalle. Optimisez la position de la sonde pour la répétabilité, puis réduisez la fréquence de stimulation selon le protocole expérimental (par exemple, taux de répétition de la chute de 10 secondes à 30 secondes).
- Utilisez le logiciel pour discriminer une activité de type AP, par exemple, en utilisant un seuil simple réglé sur ~2x l’amplitude du bruit haute fréquence et ~25 % des points d’accès les plus grands.
- Comptez les points d'accès franchissant le seuil comme des « événements », en quantifiant la fréquence et les caractéristiques des points d'accès produits.
3. Enregistrement de la mise à feu évoquée par stimulus combinée à l’étiquetage au dibromure de N-(3-triéthylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) de pyridinium
- Pour examiner les effets des colorants styryliques sur l’allumage afférent et le marquage terminal évoqués par stimulus, ajoutez la concentration appropriée d’un colorant styrylique de votre choix à la solution de bain et poursuivez l’enregistrement électrique.
- Après le temps d’exposition requis (généralement au moins 30 min), préparez la préparation pour l’observation des follicules. Dépliez le rabat cutané en retirant les goupilles de retenue et exposez la zone dermique dégagée pour révéler l’étiquetage terminal.
- Lavez le colorant externe avec une solution saline sans colorant, en effectuant 3 changements complets de solution saline.
- Incuber dans le changement final de solution saline sans colorant gazeux pendant 10 à 15 minutes pour permettre à la contamination par le colorant la plus persistante de s’échapper des membranes exposées/externes.
- Enlever le colorant non internalisé restant sur les membranes à l’aide d’un agent séquestrant (bêta-cyclodextrine sulfobutylée, 1 mM, 5 min) dans une solution saline.
- Transférez la chambre d’enregistrement sur la platine d’un microscope à épifluorescence droit et engagez la chambre avec le mécanisme de mouvement de la platine/lame.
- Illuminez la préparation avec une lumière d’excitation appropriée pour le colorant styryl. Utilisez un objectif de microscope à fluorescence 10X ou 25X pour observer le marquage des follicules (Figure 1).
