Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Détaquer et préparer la larve de drosophile du SNC
REMARQUE : Les méthodes de dissection du SNC larvaire sont clairement illustrées dans Hafer et Schedl, mais ces méthodes précédemment publiées réduisent la longueur des neurones descendants qui sont importants pour mesurer la fréquence des pointes. Ici, une méthode supplémentaire est décrite pour exciser le SNC larvaire qui maintient de longs neurones descendants intacts.
- Préparation saline.
- Préparer la dissection et l’enregistrement de la solution saline à l’acide 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-yl]éthanesulfonique (HEPES) et titrer le pH à 7,25.
- Disséquer la larve de la drosophile CNS.
- Identifier et extraire une Drosophila melanogaster errante du troisième stade de la fiole de culture et la placer dans 200 μL de solution saline (figure 1A).
- Saisissez les crochets buccaux à l’aide d’une paire de pinces fines et saisissez l’abdomen de l’asticot à l’aide d’une deuxième paire de pinces (Figure 1B).
note: N’appliquez pas trop de pression sur l’abdomen car cela pourrait entraîner une déchirure de la fine couche cuticulaire de l’asticot.
- Tirez doucement sur les crochets buccaux et l’abdomen dans différentes directions pour séparer l’extrémité caudale de l’asticot de la région de la tête et exposer les viscères de l’asticot (figure 1C).
note: Le SNC sera entrelacé avec la trachée et le tube digestif. Ne coupez pas le SNC d’un tissu pour éviter de couper les nerfs périphériques descendants.
- Extraire le SNC du tube digestif et de la trachée à l’aide d’une pince (Figure 1D).
- Si nécessaire, perturbez la barrière hémato-encéphalique en transectant manuellement le SNC postérieur aux lobes cérébraux avec des ciseaux à ressort Vannas.
note: Cela devrait être fait en fonction des propriétés physico-chimiques du produit chimique utilisé. La ligne rouge de la figure 2A est le point de transsection suggéré et le SNC transecté avec des troncs nerveux périphériques descendants intacts illustrés à la figure 2B. Le SNC transecté est prêt à être testé une fois l’étape 1.2.5 terminée.
2. Enregistrement extracellulaire du SNC de la drosophile.
- Préparez le CNS pour l’enregistrement.
- Tirez une électrode pipette en verre à partir de capillaires en verre borosilicaté jusqu’à une résistance de 5 à 15 mΩ.
- Insérez le SNC transecté dans la chambre à cire qui contient 200 μL de solution saline. Fixez une broche d’insecte non revêtue avec la pince crocodile soudée au fil de terre et insérez la broche dans la solution saline pour terminer le circuit.
- À l’aide des micromanipulateurs, orientez l’électrode vers l’extrémité caudale du SNC transecté. Éliminez l’enregistrement du bruit de fond en ajustant le niveau de seuil dans le logiciel d’acquisition/analyse avant d’entrer en contact avec les troncs nerveux périphériques.
- Aspirez les nerfs périphériques appropriés dans l’électrode d’aspiration en appliquant une légère pression négative sur la seringue.
note: La fréquence de décharge de base est corrélée au nombre de neurones attirés dans l’électrode, où plus de neurones entraînent souvent une résistance accrue de l’électrode.
- Commencer l’enregistrement extracellulaire de l’activité nerveuse descendante du SNC.
- Démarrez l’enregistrement sur le logiciel d’acquisition de données et surveillez la fréquence de tir de base. Laissez la cadence de tir s’équilibrer pendant 5 minutes avant de collecter les données de cadence de tir de base.
- Éliminer la préparation et l’enregistrement si le schéma de déclenchement du traitement de contrôle n’est pas un schéma d’éclatement similaire à celui illustré à la figure 3A.
note: Une altération du schéma de décharge suggère une activité anormale ou instable du générateur de motifs central, ce qui peut altérer la fonction neuronale.
- Après 5 min, ajoutez 200 μL de solution saline + véhicule pour porter le volume total de la chambre à 400 μL pour commencer à enregistrer les cadences de tir de contrôle.
- Une fois la ligne de base établie (3 à 5 min), prélever 200 μL de solution saline et ajouter 200 μL de l’agent expérimental solubilisé dans une solution saline.
note: Le diméthylsulfoxyde (DMSO) est le solvant recommandé pour les composés lipophiles et ne doit pas dépasser 0,1 % v/v.
- Appliquer les concentrations du médicament de manière séquentielle (concentrations faibles à élevées) et consigner chaque concentration pendant une période de temps choisie (déterminée par l’enquêteur en fonction des propriétés chimiques du médicament). Étiquetez ce point temporel de l’application du médicament dans le logiciel d’acquisition/analyse en incluant un commentaire qui inclut le médicament et la concentration finale.
note: L’activité de décharge du SNC diminuera d’environ 10 à 20 % après 30 à 50 minutes après la dissection et, par conséquent, des contrôles non traités appropriés doivent être effectués, et les traitements médicamenteux ne doivent pas dépasser cette période.
