Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation de la configuration MEA
Remarque : Commencer 15 min avant l’enregistrement.
- Transvaser le volume restant de 4AP-ACSF (liquide céphalo-rachidien artificiel 4-aminopyridine) dans un erlenmeyer de 500 ml.
- Placez l’erlenmeyer sur une étagère au-dessus de l’amplificateur MEA (réseaux de microélectrodes) et utilisez un tube pour permettre à la solution d’alimenter en continu une seringue de 60 ml. Ajustez la hauteur de l’erlenmeyer et de la seringue pour permettre une dose d’alimentation par gravité de 1 mL/min
note: La hauteur correcte dépend du diamètre intérieur du tube (ID). Pour un tube de 5/32 pouces de diamètre intérieur, 30 cm suffisent.
- Commencez à faire bouillonner le 4AP-ACSF dans l’erlenmeyer et dans la seringue avec un mélange gazeux à 95 % O2/5 % CO2.
- Laissez le 4AP-ACSF s’écouler à travers le tube de perfusion dans un bécher jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’air à l’intérieur, puis arrêtez l’écoulement de la solution.
- Connectez l’élément chauffant à la base MEA au thermostat. Placez la puce MEA sèche à l’intérieur de l’amplificateur MEA et fixez la tête de l’amplificateur. Une pipette Pasteur en plastique transfère le 4AP-ACSF vers l'entrée et le réservoir extérieur de la chambre d'enregistrement.
- Fixez la canule chauffante à un support magnétique et placez sa pointe à l’intérieur de l’orifice d’entrée de la chambre d’enregistrement. Fixez le support magnétique à une bande magnétique sur la tête de l’amplificateur MEA. Connectez la tubulure de perfusion à la canule. Connectez la canule au thermostat.
note: La canule chauffante doit être recouverte d’un tube biseauté en polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour atteindre l’orifice d’entrée de la chambre d’enregistrement et minimiser le bruit dû à son matériau métallique. Lorsque le réservoir d’entrée est correctement rempli de 4AP-ACSF, les gouttes tombant du système de perfusion ne doivent pas être visibles.
- Placez l’aiguille d’aspiration à l’intérieur du réservoir et vérifiez qu’il y a une pression négative en l’immergeant dans l’ACSF ; vérifiez qu’il y a un bruit d’aspiration constant à basse fréquence.
note: L’aiguille d’aspiration doit être placée de manière à ce que le 4AP-ACSF s’écoule juste au-dessus de la surface de la tranche de cerveau. Une conduite de vide ou une pompe à vide silencieuse peut être utilisée.
- Réglez le régulateur de débit pour qu’il autorise un débit de 1 mL/min et commencez à perfuser.
note: La perfusion par gravité élimine le bruit qui pourrait être causé par les pompes péristaltiques ; Si les pompes péristaltiques sont préférées, les modèles silencieux sont obligatoires.
- Une fois que 4AP-ACSF s’écoule à travers la canule, allumez le thermostat. Réglez la canule chauffante à 37 °C et la base MEA à 32 °C pour obtenir une température de 32 à 34 °C à l’intérieur de la chambre d’enregistrement.
REMARQUE : ATTENTION ! Ne chauffez jamais la canule sans solution à l’intérieur, sinon elle pourrait être irréversiblement endommagée. Réglez la température de la canule à un niveau supérieur à la température d’enregistrement (c’est-à-dire 32 à 34 °C) pour tenir compte du décalage de température intrinsèque entre la valeur réglée et la valeur réelle à l’extrémité de la canule chauffante et à l’intérieur de la chambre d’enregistrement. Le débit, la température ambiante et le volume de la chambre d’enregistrement influencent tous la température de la solution d’enregistrement. Les paramètres signalés à l’étape 1.9 sont optimisés pour le protocole et l’équipement décrits. Vérifiez toujours la température d’enregistrement réelle à l’aide d’un thermocouple et ajustez les paramètres si nécessaire. Ne chauffez pas la base MEA au-dessus de 34 °C pour éviter de surchauffer la tranche de cerveau.
- Placez l’électrode de référence externe dans le réservoir d’entrée de la chambre d’enregistrement.
note: Bien que les puces MEA soient équipées d’une électrode de référence interne, la chambre d’enregistrement personnalisée couvre cela. Ainsi, une électrode de référence externe doit être utilisée. Une pastille saturée de KCl (chlorure de potassium) est la plus pratique puisqu’elle est prête à l’emploi sans avoir besoin de chloration.
2. Cartographie en direct de la MEA
- Une fois que le niveau 4AP-ACSF et la température d’enregistrement sont stabilisés comme vous le souhaitez, tournez les robinets de perfusion et d’aspiration en position d’arrêt pour les arrêter temporairement.
- Transférez rapidement une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement MEA à l’aide d’une pipette Pasteur en verre inversé. Ajustez sa position sur la zone d’enregistrement MEA selon vos besoins à l’aide d’une pipette Pasteur enroulée polie au feu (Figure 1C) ou d’une brosse douce et compacte. Placez l’ancre de maintien (Figure 1D) sur la tranche de cerveau. Redémarrer la perfusion et l’aspiration en remettant leurs robinets d’arrêt en position marche.
REMARQUE : CRITIQUE ! La tranche doit être transférée et la perfusion doit redémarrer dans les 60 secondes, sinon le tissu peut mourir. L’ancre de maintien de la tranche doit être maintenue dans 4AP-ACSF pour empêcher la tranche de cerveau de bouger tout en plaçant l’ancre sur la tranche de cerveau en raison des différences de tension superficielle. L’ancrage pour fixer la tranche de cerveau sur le MEA peut être fabriqué sur mesure à l’aide de fil d’acier inoxydable et de fil de nylon (figure 1D) ou obtenu auprès de sources commerciales. La figure 1E montre la configuration expérimentale finale avec la puce MEA connectée à la tête de l'amplificateur : une tranche de cerveau reposant sur la puce MEA à l'intérieur de la chambre d'enregistrement est maintenue par l'ancrage personnalisé. L’électrode de référence (cercle rouge) et le tube en PTFE recouvrant la canule chauffante (flèche rouge) sont positionnés dans le réservoir d’entrée, tandis que l’aiguille d’aspiration (flèche bleue) est positionnée dans le réservoir de sortie.
- Prenez une photo de la tranche de cerveau à l’aide d’une caméra montée sur une platine de microscope inversé.
- Exécutez le script mapMEA sur le logiciel de l’ordinateur pour démarrer l’interface graphique afin de mapper le electrodes.
note: Le logiciel sur mesure permet à l’utilisateur de sélectionner les électrodes qui correspondent à des structures spécifiques de la tranche de cerveau. Cette étape est cruciale pour activer la bonne voie et supprimer l’activité ictale en utilisant la stimulation électrique.
- Cliquez sur le bouton Parcourir pour charger l’image de la tranche de cerveau. Assurez-vous que l’électrode de référence apparaît dans la rangée supérieure de la moitié gauche du MEA (Figure 2A, marque triangulaire). Cliquez sur le bouton Activer le pointeur, puis sélectionnez les électrodes supérieure et inférieure dans la rangée la plus à gauche de la matrice pour marquer les coordonnées XY pour le redressement de l’image et le mappage des électrodes.
- Dans le menu déroulant du type de tranche, sélectionnez Horizontal. Cochez la case Structures par défaut.
note: Il est possible de personnaliser les structures en sélectionnant le bouton Entrer de nouvelles structures. Les structures par défaut de la tranche de cerveau horizontale sont illustrées à la figure 2A.
- À l’aide des boutons-poussoirs numérotés situés sous l’image de la tranche de cerveau, sélectionnez les électrodes correspondant au retour d’intérêt et cliquez sur le bouton poussoir correspondant dans le panneau des structures pour les attribuer (Figure 2B) ; répétez cette étape pour chaque retour sur investissement.
- Appuyez sur le bouton Enregistrer : le logiciel génère un dossier de résultats nommé #EXP_LabelledElectrodes contenant un tableau indiquant les électrodes et les retours sur investissement sélectionnés.
3. Enregistrement et modulation électrique de l’activité épileptiforme
- Laissez la tranche de cerveau se stabiliser dans la chambre d’enregistrement pendant 5 à 10 minutes avant d’enregistrer.
- Allumez l’unité de stimulus au moins 10 minutes avant le protocole de stimulation pour permettre l’auto-étalonnage et la stabilisation. Démarrez le logiciel de contrôle du stimulus et vérifiez que le stimulateur et l’amplificateur MEA sont correctement connectés, comme indiqué par une LED verte sur le panneau principal du logiciel de contrôle du stimulus.
- Configurez la stimulation dans une configuration bipolaire. Sélectionnez des paires d’électrodes en contact avec la couche cellulaire pyramidale du CA1/subiculum proximal (cf.24,25) parmi celles cartographiées avec le script mapMEA (cf. section 12). À l’aide d’un fil, connectez l’une des électrodes sélectionnées à la fiche négative du stimulateur et l’autre électrode à la prise positive du même canal de stimulateur. Utilisez un autre fil pour connecter la terre du stimulateur à la terre de l’amplificateur.
- Démarrez le logiciel d’enregistrement. Pour acquérir des données, appuyez sur le bouton PLAY dans le panneau principal du logiciel d’enregistrement. Enregistrer au moins 4 décharges ictales.
note: Une fréquence d’échantillonnage de 2 kHz permet d’acquérir des potentiels de champ avec une résolution raisonnable tout en minimisant l’utilisation de l’espace sur le disque dur. Un fichier d’enregistrement de 5 minutes prend ~80 Mo. Des fréquences d’échantillonnage plus élevées peuvent être nécessaires, par exemple, pour enregistrer des artefacts de stimulus ou une activité multi-unités. Pour observer uniquement les potentiels de champ, utilisez un filtre passe-bas sous tension à 300 Hz pour couper l’activité multi-unités.
- Déterminez l’intensité du stimulus.
- Dans le logiciel de contrôle de stimulus, utilisez le panneau principal pour concevoir une durée d’impulsion de courant biphasique positive-négative carrée de 100 μs/phase.
REMARQUE : ATTENTION ! La stimulation en courant continu nécessite une impulsion de charge équilibrée pour éviter d’endommager l’équipement.
- Exécutez un test d’entrée/sortie (E/S) rapide pour identifier la meilleure intensité de stimulus. Délivrez l’impulsion de stimulation conçue à l’étape 3.5.1 à 0,2 Hz ou moins en ajoutant un intervalle entre les impulsions de 5 s ou plus sous la forme appropriée du logiciel de contrôle du stimulus. Dans l’onglet Amplitude d’impulsion, entrez une amplitude d’impulsion initiale de 100 μA/phase et augmentez de 50 à 100 μA à chaque essai jusqu’à ce que la stimulation puisse évoquer de manière fiable des événements de type interictal dans les cortex parahippocampiques (vérifiez les signaux visualisés par le logiciel d’enregistrement).
- Modulation électrique de l’ictogenèse limbique
- Programmez l’unité de stimulus pour qu’elle délivre le protocole de stimulation qui vous intéresse. Utilisez l’amplitude du stimulus identifiée lors du test d’E/S.
note: Le taux d’échec des réponses évoquées doit être de ≤20 %.
- Après l’arrêt de la stimulation, vérifiez la récupération du réseau à l’état pré-stimulus en enregistrant au moins 4 décharges ictales (comme à l’étape 3.4).
