1. Construire une arène comportementale et préparer le matériel pour permettre la stimulation optogénétique dans l’arène comportementale
- Pour construire une arène de comportement privée de lumière, construisez une boîte d’une dimension de 89 x 61 x 66 cm3 (35 » L x 24 » L x 26 » H) faite de feuilles acryliques en plexiglas de couleur noire (3 mm d’épaisseur) (voir Tableau des matériaux). Les matériaux pour construire une telle boîte devraient être disponibles dans les quincailleries locales. Placez cette boîte sur une table dans la salle de comportement (Figure 1A).
- Montez une caméra monochrome à bus série universel (USB) 3.0 équipée d’un filtre infrarouge passe-long de 830 nm et d’un objectif à monture C 8 mm F1.4 (voir le tableau des matériaux) au centre du plafond de la boîte noire. Placez deux bandes de diodes électroluminescentes (DEL) infrarouges (voir le Tableau des matériaux) sur le dessus de la table afin d’éclairer les larves dans l’arène sombre (figure 1A).
- Pour construire la plate-forme LED, procurez-vous une plaque d’aluminium carrée de 22 cm × 22 cm (de préférence peinte à la bombe avec une finition noire mate pour éliminer tout reflet). Au centre de la plaque, à l’aide d’un cutter métallique, découpez un trou suffisamment grand pour s’adapter autour de la caméra CCD.
- Couvrez la plaque métallique avec des bandes lumineuses LED rouges (voir tableau des matériaux). Soudez les fils de bande lumineuse de LED en série et introduisez les fils de bande dans un relais optocoupleur contrôlé par un microprocesseur Raspberry Pi 2B (voir le tableau des matériaux) (Figure 1B et 2).
- Installez et configurez le système d’exploitation basé sur Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux sur le processeur Raspberry Pi avant de connecter le relais optocoupleur aux bandes LED. Branchez une source d’alimentation pour alimenter les bandes LED et l’optocoupleur (Figure 2) (voir le tableau des matériaux). Montez la plate-forme LED autour de la caméra CCD (Figure 1B).
note: Le système d’exploitation Ubuntu Mate v16.04 est disponible gratuitement. Un ensemble de commandes simples basées sur Python peut être facilement adapté aux modèles de programmation de stimuli lumineux LED (voir le fichier de syntaxe).
- Assurez une irradiation homogène à différents points du comportement. Mesurez l’irradiance absolue à la surface de l’arène à l’aide d’un spectromètre et déterminez qu’elle est de ~1,3 W/m2 sur toute la surface de l’arène.
note: À cette intensité, aucun changement significatif de température n’a été observé au cours des expériences. Une autre étude a utilisé une irradiance plus élevée de ~1,9 W/m2 et n’a observé aucun changement de température au cours des expériences.
2. Préparation des larves de drosophile pour les analyses comportementales
- Maintenez les mouches avec de la nourriture anti-mouches standard (voir le tableau des matériaux) à 25 °C, 50-60 % d’humidité relative (HR) et un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h.
- Afin d'exprimer CsChrimson dans une seule paire d'ORN, croisez des femelles vierges d'une lignée UAS-IVS-CsChrimson avec des mâles d'une lignée OrX-Gal4 ('X' correspond à l'un des 21 gènes du récepteur des odeurs larvaires (Or) qui sont exprimés de manière unique dans chacune des 21 paires d'ORNs).
- Alternativement, afin d'exprimer CsChrimson dans les 21 ORN larvaires, croisez des femelles vierges d'une lignée UAS-IVS-CsChrimson avec des mâles d'une lignée Orco-Gal4 ('Orco' est le corécepteur qui est exprimé dans les 21 ORNs).
- Utilisez la ligne UAS-IVS-CsChrimson seule comme contrôle dans ces expériences.
note: Les stocks de mouches répertoriés ici sont tous disponibles au Bloomington Drosophila Stock Center (voir la table des matériaux).
- Une fois que les mouches mâles et femelles d’un croisement sont autorisées à s’accoupler et à pondre des œufs pendant 48 heures, transférez les adultes dans un flacon frais.
- À la surface du flacon alimentaire contenant des œufs, ajoutez 400 μL d’un mélange contenant 400 μM de rétinal tout trans (ATR) dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et 89 mM de saccharose dissous dans de l’eau distillée.
note: La petite quantité de saccharose favorise l’alimentation des larves de la solution ATR. L’ATR est un cofacteur nécessaire à la régulation positive de l’expression de CsChrimson. L’ATR est sensible à la lumière.
- Une fois que l’ATR est ajouté aux flacons de nourriture contenant des œufs, incubez les flacons dans l’obscurité pendant 72 h.
supplémentaires.
REMARQUE : Bien que cette étude et les deux études ci-dessus n’aient pas observé d’effets sur le comportement larvaire dus à l’alimentation par ATR, il est recommandé de contrôler les effets de l’alimentation par ATR en soumettant les lignées d’essai à la même quantité du mélange ci-dessus qui ne contient pas d’ATR.
- Extraire les larves du troisième stade (~120 h après la ponte) de la surface de la nourriture pour mouches en les faisant flotter à l’aide d’une solution de saccharose à haute densité (15 %). À l’aide d’une micropipette P1000, séparez les larves flottant à la surface de la solution de saccharose dans un bécher en verre de 1000 ml.
- Lavez les larves 3 à 4 fois en échangeant 800 ml d’eau distillée fraîche dans le bécher en verre à chaque fois. Laissez les larves se reposer pendant 10 minutes avant de les soumettre au test de comportement.
3. Dosage du comportement
- Maintenez une température constante (entre 22 et 25 °C) et une humidité constante (entre 50 et 60 % HR) dans la salle de comportement.
- Préparez le milieu de culture des larves en versant 150 ml d’agarose fondue (1,5 %) dans une boîte de Pétri carrée de 22 cm x 22 cm. Une boîte de Pétri est versée pour chaque essai de l’essai, soit 8 à 10 essais par expérience. Laissez l’agarose se solidifier et refroidir pendant 1 à 2 h dans les boîtes de Pétri avant de les utiliser dans le test de comportement.
- Ne transférez pas plus de 20 larves du troisième stade préparées au centre de la boîte de Pétri (figure 1C). Couvrez la boîte de Pétri avec son couvercle. Placez la boîte de Pétri dans l’arène comportementale sous la caméra CCD.
note: Selon l’expérience, les tests de comportement sont généralement effectués pendant 3 à 5 minutes. Si un odorisant est utilisé dans le test pour fournir des repères de guidage, il a été observé que le gradient d’odeur résultant reste stable pendant environ 5 min. Il n’est pas recommandé d’allonger les temps de dosage. Aucun effet délétère sur les larves dû à la déshydratation ou à une exposition prolongée à la lumière rouge à 630 nm n’a été observé au cours de ces périodes.
- Allumez la source de lumière LED infrarouge de 850 nm pour visualiser les larves dans la vidéo. Démarrez la caméra CCD pour enregistrer le mouvement des larves.
- À l’aide du logiciel associé au processeur Raspberry Pi, programmez la procédure pour administrer les modèles appropriés de stimulation par la lumière rouge.
note: Un ensemble de commandes simples basées sur Python peut être facilement adapté aux modèles de programmation de stimuli lumineux LED (voir le fichier de syntaxe).
