Inhibition médiée par les microARN des courants postsynaptiques excitateurs dans des tranches d’hippocampe de souris

Résumé

Source : Thalhammer, A., et al. Combinaison de l’optogénétique avec des microARN artificiels pour caractériser les effets de l’inactivation des gènes sur la fonction présynaptique au sein de circuits neuronaux intacts. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’inhibition des courants synaptiques excitateurs par les microARN dans des tranches de cerveau d’hippocampe de souris. Les neurones CA3 ont été infectés par un vecteur viral recombinant hébergeant une construction pour exprimer un rapporteur fluorescent, un canal membranaire activé par la lumière et un microARN qui régule à la baisse l’expression des canaux calciques voltage-dépendants. Lors de la mise en place d’une tranche dans une chambre d’enregistrement et du patchage d’un neurone CA1 à l’aide d’une pipette enregistreuse, des impulsions lumineuses ont été utilisées pour stimuler le canal activé par la lumière, ce qui a entraîné un afflux d’ions et généré un potentiel d’action. L’absence de canaux calciques voltage-dépendants dans les neurones CA3 inhibe la libération de neurotransmetteurs, provoquant une inhibition des courants postsynaptiques excitateurs dans les neurones CA1 connectés synaptiquement.

Protocole

1. Évaluation du rôle des protéines présynaptiques dans les circuits neuronaux intacts par stimulation ciblée des neurones renversés avec l’optogénétique

REMARQUE : Le protocole suivant nécessite une expérience préalable des enregistrements électrophysiologiques dans des tranches cérébrales aiguës et l’accès à une configuration électrophysiologique.

1. Injecter stéréotaxiquement dans le cerveau un virus adéno-associé recombinant de sérotype mosaïque 1 et 2 (rAAV1/2). Déterminez les coordonnées stéréotaxiques de la région cérébrale d’intérêt à l’aide d’atlas stéréotaxiques pour le cerveau de souris ou de rat.
   1. À l’aide d’un extracteur de micropipettes, tirez les micropipettes d’injection avec de longues tiges de Ø 7 à 9 μm ; fixez les micropipettes d’injection sur les tiges avec des ciseaux. À l’aide d’un marqueur fin et de papier millimétré, placez des marques d’étalonnage sur les micropipettes d’injection tous les 2 mm.
   2. Anesthésie l’animal avec de l’isoflurane et fixe-le dans l’appareil stéréotaxique.
   3. Gardez l’animal au chaud tout au long de l’opération à l’aide d’un coussin chauffant réglé à 37 °C.
   4. Protégez les yeux avec un lubrifiant oculaire.
   5. Rasez la fourrure de la tête avec un rasoir électrique.
   6. Étalez de la povidone iodée sur le crâne rasé à l’aide d’un coton-tige.
   7. Sous un microscope à dissection, faites une incision médiane.
   8. Nettoyez la surface du crâne avec un coton-tige, afin de rendre le bregma et le lambda visibles.
   9. Placez la micropipette d’injection dans son support. Fixez le support au bras stéréotaxique.
   10. Déterminer les coordonnées x et y du site d’injection par rapport au bregma et/ou au lambda.
   11. Utilisez une perceuse pour amincir le crâne sur la zone cible.
       note: Utilisez des mouvements circulaires doux et évitez de percer le crâne car cela endommagerait la surface du cerveau.
   12. S’il y a des saignements, absorbez l’excès de sang avec du papier essuie-tout.
       note: Un excès de sang rendra difficile la détermination correcte de la coordonnée z.
   13. Chargez ≤2 μL de virus dans la micropipette d’injection par capillarité.
   14. Amener la micropipette d’injection aux coordonnées x et y du site d’injection.
   15. Calculez la coordonnée z à partir de la dure-mère et abaissez lentement la pipette dans le cerveau.
   16. Lorsque la coordonnée z est atteinte, attendez 3 min pour permettre l’ajustement des tissus.
   17. Appliquer une faible pression positive à l’aide d’une seringue de 1 mL reliée par un tube flexible à l’arrière de la micropipette d’injection. Surveiller visuellement la vitesse d’éjection du virus de la micropipette d’injection à l’aide du microscope de dissection et en utilisant les marques d’étalonnage comme points de référence.
       note: Le virus doit être injecté à un rythme lent (<100 nL/min) pour éviter d’endommager les tissus.
   18. Lorsque l’injection est terminée, attendre 5 min, prélever la micropipette d’injection de 0,2 mm, attendre encore 5 min, pour éviter le reflux du virus.
   19. Retirez lentement et complètement la micropipette d’injection du cerveau et jetez-la dans un récipient rempli d’eau de Javel.
   20. Mouillez le crâne avec une solution physiologique et suturez la peau avec 3-4 points de suture.
   21. Appliquez la pommade à la gentamicine sur la plaie.
   22. Placez l’animal dans une cage propre avec des granulés de nourriture et sous une lampe chauffante jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement.
2. ≥15 jours après l’injection, décapiter les animaux sous anesthésie profonde à l’isoflurane.
3. Préparer des coupes cérébrales aiguës de la région cérébrale d’intérêt à l’aide d’un vibratome à l’aide d’une solution de liquide céphalo-rachidien artificiel glacé gazeux (95 % O₂, 5 % CO₂), contenant (en mM) : 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH₂PO₄, 1,5 MgCl₂, 1 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 2 pyruvate de sodium et 18 glucose (osmolarité ajustée à 300 mOsm). Par exemple, si l’objectif est d’analyser la transmission synaptique des neurones pyramidaux CA3 à CA1, préparez des coupes sagittales de la formation hippocampique (350 μm d’épaisseur).
   note: À partir de cette étape, travaillez dans des conditions de faible luminosité pour éviter l’activation de la sonde optogénétique par la lumière ambiante.
4. Laissez les tranches récupérer pendant 30 min à 37 °C dans le même aCSF dans une chambre conçue pour contenir les tranches de cerveau. Conservez les tranches dans la même chambre de tranche de cerveau à température ambiante jusqu’à l’enregistrement.
   note: Dans ces conditions, les tranches peuvent être maintenues en bonne santé jusqu’à 6 à 8 heures.
5. Transférez une tranche dans une chambre d’enregistrement immergée et superfusionnez-la avec 2 mL/min du même aCSF utilisé pour la récupération, complété par 1,5 mM de CaCl₂ (Ca²⁺ total : 2,5 mM) et sans pyruvate de sodium.
   note: Les tranches sont préparées et maintenues à une faible concentration de Ca²⁺ (1 mM) afin de minimiser la toxicité. Les enregistrements sont réalisés en 2,5 mM Ca²⁺ pour favoriser la libération des vésicules.
6. Vérifiez brièvement le signal du rapporteur fluorescent exprimé (par ex. TdTomate ; Figure 1B) pour déterminer la localisation et l’intensité de l’infection.
7. Remplissez une électrode patch avec une solution intracellulaire contenant (en mM) : 110 K-gluconate, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N, N, N, N′, N'-acide tétraacétique (EGTA), 3 MgCl₂, 4 sel de magnésium adénosine 5'-triphosphate (Mg-ATP), 0,5 sel de guanosine 5'-triphosphate trisodique (Na 3-GTP), 20 K₂-phosphate de créatine, tampon d’acide 10-4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique ajusté avec KOH (HEPES-KOH, pH 7,28, 290 mΩ).
   note: Utilisez une électrode patch avec une résistance de pipette de 5 à 6 mΩ.
8. Sous éclairage infrarouge, obtenez une configuration de cellules entières étanche à partir d’un neurone recevant des entrées synaptiques des neurones infectés. Par exemple, si les neurones pyramidaux CA3 ont été infectés, patchez les neurones pyramidaux dans le tractus proximal à médial de la région CA1 (Figure 1C).
   note: La résistance série peut être laissée non compensée, mais elle doit être constante et faible (≤20 MΩ).
9. Utiliser la pharmacologie pour isoler les courants synaptiques étudiés. Par exemple, si l’objectif est d’étudier la transmission synaptique excitatrice, bloquez la transmission synaptique inhibitrice avec une bicuculline de 10 μM.
10. Évoquer des courants synaptiques, par exemple des courants postsynaptiques excitateurs (EPSC), à l’aide d’un laser bleu de 473 nm couplé à une fibre optique (Ø ≤250 μm) positionnée sur le somata des neurones infectés (e.g. neurones pyramidaux CA3).
    1. Ajustez la durée de stimulation au minimum, afin de réduire la possibilité d’évoquer plus d’un potentiel d’action par impulsion lumineuse. Si vous utilisez ChETA, réglez-le sur 2 ms.
    2. Ajuster l’intensité de stimulation du laser pour produire des courants synaptiques faibles mais clairement détectables (amplitude de crête de ≤50 pA pour les EPSC enregistrées à un potentiel de maintien de -70 mV entre les neurones pyramidaux CA3 et CA1 ; Figure 1D). Si vous utilisez ChETA et une fibre optique de 250 μm de diamètre, des forces de stimulation de 1 à 3 mW à la sortie de la fibre devraient convenir.
       REMARQUE : si l’intensité du laser ne peut pas être réglée, utilisez des filtres à densité neutre.
    3. Dirigez la lumière laser de 473 nm sur les somates des neurones infectés, mais pas sur leurs axones. Par exemple, faites la lumière sur CA3 somata, et loin des collatéraux de Schaffer, pour éviter la dépolarisation directe des axones.
    4. Appliquez de la tétrodotoxine (TTX ; 0,5 μM), un bloqueur des canaux sodiques, à l’échantillon pour confirmer que les canaux sont déterminés par le potentiel d’action.
    5. Dans différents enregistrements, appliquez un bloqueur sélectif au courant synaptique étudié pour confirmer que la stimulation est sélective.
       note: Par exemple, appliquer la 2,3-dioxo-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo[f]quinoxaline (NBQX, 10 μM) sur des EPSC médiées par le récepteur du glutamate de type acide α amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA).
    6. Comparer les courants synaptiques évoqués optiquement et électriquement dans la même tranche de cerveau aiguë en réponse à une stimulation répétitive (≥2 stimuli à ≤20 Hz). Un degré similaire de facilitation synaptique ou de dépression devrait être observé entre la stimulation électrique et optique lors de l’utilisation d’un microARN de contrôle (miR), suggérant ainsi que des mécanismes cellulaires similaires sont activés par les deux types de stimulations.
       note: Les étapes ci-dessus sont nécessaires pour s’assurer que la stimulation optique n’induit pas une dépolarisation directe des boutons présynaptiques, contournant ainsi certains mécanismes de transmission synaptique.

Résultats

Graphique 1. Évaluation du rôle de Ca_v2.1[EFa] et Ca_v2.1[EFb] dans l’hippocampe natif par stimulation ciblée des neurones renversés avec l’optogénétique. (A) Schéma de la cassette d’expression des constructions rAAV utilisées pour l’infection in vivo. (B) Coupe de l’hippocampe montrant que la fluorescence de TdTomato est limitée ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tranches de cerveau Préchambre	Appareil de Harvard	BSC-PC
Imageur basé sur caméra CCD	Bio-Rad	ChemiDoc™ MP
Réactifs de culture cellulaire	Technologies de la vie
forer	Avant-garde	K.1030
EGTA	sigma	E4378
Pommade à la gentamicine	Pharmacie de proximité
glucose	sigma	Réf. G7021
HEPES	sigma	Référence 54459
Micropipettes d’injection	Narishige	GD1
Sels inorganiques et détergents	sigma
K-2-créatine phosphate	Calbiochimie	237911
KGluconate	Fluka	Référence 60245
laser	Technologies Laserglow	Référence : Réf. : Réf. : 0473-GFM-00100-03
membrane	Amersham	Protran™ 0,2 μm NC
MgATP	sigma	A9187
Porte-micropipette	Narishige	IM-H1
Extracteur de micropipette	Narishige	PC-100
Na3GTP	sigma	Référence G8877
NaPyruvate	sigma	P5280
Lubrifiant oculaire	Pharmacie de proximité	Lacrigel
Povidone iodée	Pharmacie de proximité	Bétadine
Appareil stéréotaxique	WPI
Tétrodotoxine	Tocris	N° 1069	toxique
Vibratome	Leica	VT1200S