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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Charge de colorant calcique
- Choisissez des colorants calciques en fonction de la préférence de chaque chercheur. Ici, nous utilisons Fluo-8AM ou Fluo-4AM. Cependant, cette méthode peut également être appliquée à d’autres colorants : dissoudre les colorants calciques dans du DMSO dans une solution de 1 mM et des copolymères séquencés à 1 % (par exemple, l’acide pluronique-127) jusqu’à un volume final de 50 μL et du sonicate pendant 10 min.
- Ajouter la solution d’aCSF à une concentration finale de 10 μM, 0,01 % de copolymères séquencés pour les tranches de cerveau.
- Pour les animaux adultes, (>12 semaines), pipeter les colorants (50 μL) directement sur les tranches de cerveau, et maintenir pendant 75 min pour permettre une meilleure pénétration du colorant dans les couches profondes.
- Pour assurer une oxygénation adéquate de la tranche immergée pendant l’incubation du colorant, préparez une chambre de chargement en verre avec un couvercle fermé (bocal circulaire de 2,5 cm de diamètre, 3,5 cm de hauteur) avec des colorants calciques dilués dans 2,5 mL d’aCSF. Oxygéner en continu avec 95 % O2/5 % CO2. Ne faites pas de bulles.
- Après le chargement du colorant, laver le tissu avec de l’aCSF et le transférer dans le système d’incubation, en réduisant lentement la température à 15 - 16 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour une utilisation expérimentale.
2. Enregistrements électrophysiologiques et imagerie
- Placer le tissu dans une chambre d’enregistrement immergée sous un microscope et perfuser avec de l’aCSF oxygéné à un débit de 4 à 5 mL/min, soit à RT (~22 °C), soit à une température physiologique (~35 °C). Maintenez le tissu en place à l'aide d'une « harpe » faite sur mesure, faite de fils de nylon ou d'or tendus et collés sur un morceau de fil d'or ou de platine en forme de U.
- Pour l’électrophysiologie :
- Préparez des pipettes d’enregistrement à partir de verre borosilicaté de 1,5 mm (1,19 mm de diamètre intérieur) à l’aide d’un extracteur de micropipette pour obtenir une résistance finale de 5 à 6 MΩ.
- Remplissez la pipette avec 3 à 4 μL de solution interne et visualisez les cellules sous contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) à l’aide d’une caméra CCD. La solution intracellulaire doit être soigneusement adaptée à chaque expérience pour obtenir des résultats expérimentaux.
- Positionnez la pipette tout en maintenant la pression positive appliquée par un orifice d’aspiration sur le porte-pipette sur la membrane d’une cellule à l’aide d’un micromanipulateur. Aucun grattage membranaire préalable n’est nécessaire puisque l’ILM a été retiré de la rétine. Une fois la pipette sur la cellule, appliquez une légère pression négative sur la pipette pour obtenir une étanchéité gigaohm. Ensuite, rompez la membrane cellulaire avec une brève quantité de pression négative.
- Effectuez des enregistrements de pinces de courant ou de tension sur l’ensemble de la cellule en utilisant des techniques standard, le cas échéant.
- Imagerie calcique :
- Pour une seule longueur d’onde d’excitation de Fluo-4, filtrez la lumière d’excitation à travers un filtre passe-bande 460 - 490 nm et la lumière émise à travers un filtre passe-bande 515 - 550 nm. Utilisez un appareil photo numérique haute vitesse pour l’enregistrement le plus rapide et le plus sensible. Acquérez des images selon vos besoins.
- Mesurer les altérations de la fluorescence en fonction du temps soit à une seule longueur d’onde (Fluo-4).