Test des connexions monosynaptiques à l’aide de tétradotoxine et de canaux sodiques résistants aux tétrodotoxines

Résumé

Source : Zhang, X. et al., Examen des connexions monosynaptiques chez la drosophile à l’aide de canaux sodiques résistants aux tétrodotoxines. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre comment tester les connexions monosynaptiques à l’aide d’une mouche transgénique. La mouche a des canaux sodiques résistants aux tétrodotoxines et des canaux activés par la lumière rouge dans ses neurones présynaptiques, qui sont optogénétiquement excités pour transmettre des signaux aux neurones postsynaptiques.

Protocole

1. Préparer les mouches et identifier les lignées promotrices GAL4

1. Sélectionnez une lignée promotrice GAL4 et croisez-la avec des mouches porteuses à la fois du transgène UAS-NaChBac et d’un transgène optogénétique pour l’activation.
   note: UAS-CsChrimson est choisi en raison de sa conductance élevée et de la facilité avec laquelle il active les potentiels d’action médiés par le canal sodique résistant à la tétrodotoxine (TTX) (NaChBac). UAS-NaChBac et UAS-CsChrimson sont disponibles dans le Bloomington Stocks Repository.
2. Préparez le rétinien tout-trans sous forme de solution mère dans de l’éthanol (35 mM) et conservez la solution au congélateur à -20 °C.
3. Mélangez 28 μL de ce bouillon dans environ 5 ml de nourriture réhydratée pour flocons de pommes de terre et ajoutez ce mélange au sommet d’une fiole de milieu de drosophile conventionnel.
4. Élever des mouches adultes exprimant csChrimson sur des aliments contenant 0,2 mM de tout trans-rétinal pendant 1 à 3 jours.

2. Préparer le stock TTX

1. Créer une solution mère de 1 mM de TTX dans de l’eau distillée ou déminéralisée. Conservez cette solution dans un réfrigérateur de laboratoire pendant plusieurs mois. Vérifiez les politiques de l'établissement concernant l'entreposage du TTX, car de nombreux établissements classent le TTX comme une substance dangereuse ou contrôlée.

3. Préparer les mouches pour l’électrophysiologie

1. Collectez des mouches adultes âgées de 1 à 3 jours qui sont élevées avec de la nourriture entièrement trans-rétinienne.
2. Mettez les mouches dans un flacon à scintillation en verre. Placez le flacon sur de la glace pendant 1 min pour immobiliser les mouches.
3. À l’aide d’une pince grossière, insérez une mouche dans une chambre d’enregistrement sur mesure. La chambre se compose d’un cercle de 3 1/2 » découpé au laser dans de l’acrylique 1/16 ». Découpez un trou de 3/4" au centre, où une feuille personnalisée est fixée avec de l’époxy en 2 parties. La feuille contient un espoir de forme triangulaire dans lequel la mouche est insérée.
4. Appliquez de la cire ou de l’époxy durcissable aux rayons ultraviolets (UV) autour de l’animal pour le fixer fermement dans la chambre d’enregistrement.
5. Éclairez la préparation avec une fibre optique à col de cygne pour la visualisation au stéréomicroscope. Réglez les fibres du col de cygne pour un éclairage oblique en les ajustant de manière à ce qu’elles éclairent la mouche directement sur le côté.
6. Ajustez le niveau de lumière au réglage le plus bas possible qui permet toujours une visualisation claire de la mouche. Cette intensité lumineuse variera d’une expérience à l’autre.
   note: Ce protocole peut être adapté en utilisant une méthode d’explantation cérébral in situ.
7. Récupérez le sérum physiologique d’enregistrement externe. La solution saline contient en mM : 103 chlorure de sodium, NaCl, 3 chlorure de potassium, KCl, 5 acides N-tris(hydroxyméthyl)méthyl-2-aminoéthane-sulfonique, 8 tréhalose, 10 glucose, 26 bicarbonate de sodium, NaHCO₃, 1 dihydrogénophosphate de sodium, NaH₂PO₄, 1,5 chlorure de calcium, CaCl₂, et 4 chlorure de magnésium, MgCl₂ (ajusté à 270-275 mΩ). La solution saline est remplie de bulles avec 95 % d’O₂/5 % de CO₂ (carbogène) et a un pH ajusté à 7,3.
8. Placez 4 à 6 gouttes de solution saline d’enregistrement extracellulaire sur la préparation pour mouches. À ce stade, augmentez le niveau de lumière au microscope de dissection pour une meilleure visibilité.
9. Affûtez un fil de tungstène à l’aide de l’électrolyse. Pour fabriquer le fil, préparez une solution saturée de nitrate de potassium, KNO₃ et appliquez environ 20 V de courant alternatif (CA) tout en trempant la pointe du fil dans la solution 20 fois pendant 100 ms chacune jusqu’à ce que la pointe soit affûtée. Utilisez le fil de tungstène aiguisé pour enlever la cuticule sur la tête de la mouche et ainsi exposer le cerveau.
10. Exposez davantage le cerveau en enlevant la trachée et les corps adipeux qui l’entourent. Si vous accédez aux lobes antennaires, utilisez un fil de tungstène plié ou un outil similaire pour rentrer doucement les antennes sous la chambre d’enregistrement de la feuille afin d’augmenter la visibilité. À l’aide d’une pince tranchante, on arrache doucement la gaine gliale qui recouvre la zone d’intérêt où les enregistrements seront effectués.
11. Transférez la chambre d’enregistrement sur le banc d’électrophysiologie. Commencer immédiatement la perfusion avec une solution saline d’enregistrement externe bouillonnée de carbogène pour préserver le cerveau. Le réservoir de solution saline est placé au-dessus de la platine du microscope et est alimenté par gravité dans la préparation. Utilisez une conduite d’aspiration et un erlenmeyer de 2 L pour recueillir les déchets salins.

4. Obtenir l’enregistrement de cellules entières

1. Tirez les pipettes patch sur un extracteur de pipette commercial. Consultez le manuel pour les réglages permettant d’obtenir une pipette appropriée avec une résistance de pointe proche de 7 mΩ.
2. Ajouter 4 μL de solution d’enregistrement interne dans une pipette patch. La solution saline interne se compose de 140 aspartate de potassium, de 10 acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES), de 4 adénosine triphosphate de magnésium (MgATP), de 0,5 sel trisodique de guanosine 5'-triphosphate hydraté (Na₃GTP), de 1 acide tétraacétique d'éthylène glycol (EGTA) et de 1 chlorure de potassium (KCl) en mM.
3. Configurez l’amplificateur patch clamp pour l’enregistrement de cellules entières. Mettez à zéro le décalage de l'amplificateur et réglez l'amplificateur pour qu'il émette des impulsions de test. Ici, un amplificateur Patch clamp 2 400 d’AM Systems est utilisé.
4. Appliquez une pression positive à travers la pipette et approchez-vous de la cellule. Utilisez un micromanipulateur pour diriger la pipette et entrer en contact avec la cellule. Relâchez la pression positive. Réglez le potentiel de maintien de la membrane à -60 mV. La pipette doit former un joint gigaohm avec la membrane de la cellule, comme en témoigne un faible courant de maintien sub-picoampère.
   note: Si vous utilisez un ciblage cellulaire guidé par la protéine fluorescente verte (GFP), essayez de minimiser l’utilisation de la lumière épifluorescente pour prévenir l’activation de ChR2 et la dépression synaptique potentielle. Attendez également quelques minutes avant d’appliquer l’étape 5.
5. Réglez l’amplificateur pour qu’il délivre des impulsions de test de -50 mV à -60 mV. Ce réglage est standard sur les amplificateurs à pince patch. Les impulsions de test révéleront un grand transitoire capacitif représentant le courant nécessaire pour charger la pipette patch. Supprimez les transitoires capacitifs en ajustant les boutons de compensation de capacité sur l’AM 2400 ou un amplificateur similaire.
6. Appliquez de brèves impulsions de pression négative pour rompre la membrane cellulaire et obtenir une configuration de cellule entière.
   note: Une configuration cellulaire entière est observée lorsqu’il y a une forte augmentation des transitoires capacitifs montrant la capacité du neurone. Une légère augmentation du courant de maintien (ligne de base) sera probablement également observée. Réglez l'amplificateur sur le mode de pince de courant et ajustez le potentiel de la cellule sur -50 à -60 mV.

5. Tester la connectivité synaptique

1. Configurez le système d’acquisition de données (DAQ) pour qu’il déclenche un pilote de diode électroluminescente (LED) afin de générer des impulsions lumineuses. Ici, un système d’acquisition de données National Instruments est utilisé avec Matlab pour fournir un signal analogique à un pilote de LED. L’intensité des LED est réglée via le signal analogique vers le pilote. La LED est une LED de longueur d’onde de 620-630 nm.
2. Positionnez la LED rouge haute puissance directement sous la préparation. Réglez l’intensité lumineuse de manière à ce que 0,238 mW/mm² atteigne la mouche.
3. Activez les neurones présynaptiques tout en enregistrant à partir de la cellule postsynaptique d’intérêt. Réaliser l’activation cellulaire par optogénétique, pharmacogence ou par stimulation nerveuse. Ici, csChrimson et de brèves impulsions de lumière rouge sont appliquées.
   REMARQUE : Les connexions synaptiques peuvent être surveillées soit dans la pince de courant en tant que potentiels postsynaptiques excitateurs (EPSP), soit dans la pince de tension en tant que courants postsynaptiques excitateurs (EPSC). Une connexion synaptique doit être visible avant l’application du TTX en réponse à une impulsion lumineuse de 40 ms. Si aucune connexion n’est observée, il est peu probable que les neurones soient synaptiquement connectés que ce soit de manière mono- ou polysynaptique. Le potentiel de maintien peut être ajusté pour mettre l’accent sur les connexions excitatrices ou inhibitrices en conséquence.
4. Si une connexion est observée dans une solution saline normale, ajoutez du TTX au système de perfusion pour obtenir une concentration finale de 1 μM. Utilisez une pompe de recirculation pour capturer et réutiliser la solution saline afin de conserver le TTX. La pompe péristaltique aspirera la solution saline du bain et la renverra dans le réservoir salin.
5. Ajustez la vitesse de la pompe pour fournir un vide fort et constant qui ne permet pas au niveau de salinité dans le bain de monter et de descendre.
   note: L’application de TTX devrait entraîner l’arrêt de l’activité de pointe dans le neurone qui est surveillé dans la cellule entière. Cela confirme qu’une quantité suffisante de TTX a été ajoutée à la solution saline.
6. Appliquez à nouveau de brèves impulsions de lumière rouge (40 ms pour chaque impulsion). À ce stade, toute connexion synaptique qui subsiste est probablement monosynaptique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
UAS-csChrimson	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Référence 55135	Utilisé comme activateur neuronal
UAS-NaChBac	Centre de stock de drosophile de Bloomington	Référence 9466	Excitabilité des résotores dans les cellules du TTX
Tétrodotoxine	Tochris	N° 1078	Une autorisation spéciale peut être nécessaire pour acheter du TTX car il s’agit d’une substance contrôlée
tous trans-rétiniens	Sigma-Aldrichall trans-rétinal	R2500	Nécessite un cofacteur pour la channelrhodopsine
Tôle d’acier inoxydable 321 soudable, 0,002 » d’épaisseur, 10 » de large	McMaster Carr	Référence 3254K7	Utilisé pour fabriquer un porte-mouche personnalisé. La feuille personnalisée peut être découpée au laser à pololu.com partir du fichier PDF fourni
Microscope de dissection	Zeiss	Stemi 2000-C	Utilisé pour la dissection de la préparation
Waxer	Almore	Cire Eectra 66000	Utilisé pendant la dissection pour sécuriser la mouche dans le fleuret
paraffine	Joann	4917217	Utilisé avec cire
Pince numéro 5	Outils scientifiques fins	#5CO	Utilisé pour la dissection et le dégainage
Ciseaux de dissection	Outils scientifiques fins	Référence 15001-08	Utilisé pour enlever des parties de la cuticule lors de la dissection
Fil de tungstène	Systèmes A-M	Référence 797500	À utiliser avec l’électrolyse pour fabriquer des aiguilles aiguisées pour la dissection
Pompe péristaltique de réciculation	Pompes simples (Amazon)	PM200S	pour recirculation TTX
Régulateur de vitesse pour pompe péristaltique	Zitrades (Amazon)	n/a	Contrôleur de gradation PWM pour lumières LED ou ruban, 12 volts 8 ampères, interrupteur de luminosité réglable contrôleur de gradateur DC12V 8A 96W pour bande lumineuse LED B
Régulateur d’air comprimé de précision Versa-Mount	McMaster Carr	1804T1	Pour l’application d’une pression positive pendant le ragréage
Cabines en verre	Instruments de précision mondiaux	TW150F-3	Pour pipettes patch
Jauge polyvalente	McMaster Carr	Référence 3846K431	Manomètre pour régulateur de pression
Caméra d’électrophysiologie	Dage MTI	IR-1000	Toute caméra qui fonctionne dans la plage IR (850 nm) fonctionnera. Vous ne souhaitez pas utiliser l’éclairage rouge car cela peut activer csChrimson
LED IR	Thorlabs	M850F2	Pour un éclairage oblique
Fibre optique pour LED IR	Thorlabs	Référence M89L01	Se couple à la LED IR
Lentille d’objectif	Olympus 40X	LUMPlanFLN	Cela peut être utilisé sur la plupart des microscipes et fonctionne bien pour visualiser les neurones des mouches.
LED ambre	Thorlabs	M590L3d	Pour visualiser l’appel d’offres et mCherry
LED bleue	Thorlabs	M470L3d	Pour visualiser la GFP
Jeu de filtres GFP	Chroma	Réf. 49011	Pour visualiser la GFP ou stimuler le canal2rhodopsine
Jeu de filtres mCherry personnalisé	Chroma	ET580/25X et T600LPXR (à partir de l’ensemble 49306) mais avec une optique de barrière/émission ET610LP	À utiliser uniquement si vous souhaitez patcher des neurones identifiés avec channel2rhodopsin
Dichroïque pour combiner LED ambre et bleue	Thorlabs	DMLP550R	Utilisez uniquement le patch sous mCherry et excitez channel2rhodopsin avec de la lumière bleue.
LED rouge	LEDSupply	Cree XPE 620 - 630 nm	Utilisé pour piloter csChrimson
Pilote de LED	LEDSupply	Référence 3021-D-E-1000	Utilisé pour piloter les LED pour la stimulation optogénétique
manipulateur	Instruments Sutter	MP-225	Utilisé pour positionner la pipette pendant les enregistrements
Amplificateur Patchclamp	Systèmes A-M	Modèle 2400	Un amplificateur équivalent convient
Filtre Bessel	Warner Instruments	LPF 202A	Filtre auxiliaire utilisé pour filtrer la trace de courant vers l’oscilloscope pendant le patching.
Système d’acquisition de données	National Instruments	NI PCIe-6321 781044-01	Utilisé pour enregistrer des données de l’amplificateur à l’ordinateur
Bloc de connexion - Borne BNC BNC-2090A	National Instruments	Référence 779556-01	Utilisé pour connecter l’amplificateur à la carte DAQ.
Feuille d’acier	McMaster Carr	Référence 3254K7	Feuille d’acier pour chambre d’enregistrement personnalisée
Aimants	K&J Magnetics	D42	Pour fixer la chambre d’enregistrement au support de l’anneau
1/16" Acrylique coulé cellulaire transparent	Pololu		Utilisé pour fabriquer une chambre d’enregistrement personnalisée. L’acrylique peut être découpé au laser à pololu.com partir du fichier PDF fourni