Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Fabrication des électrodes de stimulation
- Pour fabriquer une électrode de stimulation, coupez six morceaux de fils de raccordement miniatures de 10 cm de long, retirez 2 cm de revêtement à une extrémité et 1 cm à l’autre extrémité.
- Torsadez deux câbles ensemble et soudez-les sur le côté pelé le plus court.
- Procurez-vous une bande d’emballage à trois bandes de n’importe quel circuit intégré avec le boîtier SOT-353 (Small Outline Transistor-353).
- Cousez les fils torsadés à travers les trois trous du colis. Le segment pelé le plus long des fils doit se trouver dans les cavités de l'emballage. Positionnez les câbles de manière à ce que l’extrémité de l’isolant soit alignée avec le bord des trous.
- Mettez le ciment dentaire dans les trous pour fixer les fils.
prudence: Le ciment dentaire doit être suffisamment dense pour éviter de fuir dans la cavité de l’emballage.
- Une fois le ciment solidifié (minimum 10 min), retournez l’emballage et mettez une fine couche de superglue dans le trou pour former un joint étanche vers le ciment poreux. Évitez de coller les fils pelés.
- Torsadez les câbles ensemble du côté pelé le plus court et soudez-les (Figure 1A).
- Saisissez la partie pelée la plus longue des fils à l’aide de la pointe d’une pince à épiler, enroulez-les et enroulez-les dans les cavités (Figure 1B). Si nécessaire, coupez l’excédent de câble.
2. Fabrication des électrodes d’enregistrement
- Pour fabriquer une électrode triplet d’enregistrement (Figure 1C-D), coupez un morceau de tube en acier inoxydable d’un centimètre de long à l’aide d’une scie rotative à grande vitesse. Retirez l’ailette des extrémités du tube à l’aide d’une aiguille pointue et assurez-vous que le tube est exempt de débris et complètement perméable.
note: N’utilisez pas de pinces, car elles déformeraient le tube.
- Pliez une goupille d’espacement en carton plaqué or d’une longueur minimale de 3 cm pour former un support en forme de J. Coupez la branche la plus longue de la forme en « J » et soudez-la ensemble pour récupérer la forme d'origine afin de faire un joint détachable entre la longue partie linéaire, qui sera maintenue par le dispositif stéréotaxique, et la forme en « U », qui maintiendra l'électrode, et servira de point d'ancrage. Collez le tube et la jambe la plus courte du support en « J ». Collez quelques barres supplémentaires de 1 cm de long, si nécessaire, pour plus de stabilité.
- Coupez 3 morceaux de fils d’électrode de 2,5 cm de long avec des ciseaux ultrafins en acier inoxydable. Assurez-vous que la coupe est claire et nette et que l’isolant est intact à la surface circulaire du fil d’électrode. Assurez-vous également que la pointe coupée n’est pas pliée en raison de la force appliquée. Pliez de 1 ou 2 mm à une extrémité de chacun des fils à différents angles (par exemple, un droit à gauche, un à 45° et un angle droit) pour les rendre distincts.
- Remplissez le tube avec les fils. Choisissez un espacement approprié des électrodes pour l’expérience (par exemple, pour l’enregistrement du potentiel de champ local cortical (LFP) et de la densité de la source de courant (CSD), la saillie recommandée des extrémités des fils à partir de l’ouverture du tube est de 4,5 mm, 4,1 mm et 3,7 mm, respectivement). Notez quel fil correspond à quelle profondeur pour maintenir un ordre correct des canaux.
- Une fois que les fils s’alignent l’un à côté de l’autre et sont parallèles au tube, pour fixer les fils d’électrode, placez une seule goutte de superglue liquide aux deux extrémités du tube avec une aiguille pointue. Assurez-vous que la colle s’écoule dans le tube en raison de l’effet capillaire, mais pas vers les sites d’enregistrement aux extrémités saillantes.
- Préparez une carte d’interface d’électrode avec un micro-connecteur approprié compatible avec le système d’enregistrement à utiliser.
- Introduisez les extrémités pliées des fils dans les trous de la carte d’interface d’électrode correspondant au canal d’enregistrement souhaité. Lorsque tous les fils sont en place, enfoncez les broches dorées dans les trous à l’aide d’une pince à épiler.
note: Les broches en or peuvent être fixées en place à l’aide de ciment dentaire, mais dans la plupart des cas, elles sont suffisamment stables sans cette étape de sécurité.
3. Anesthésie
- Placez l’animal dans une chambre d’induction d’anesthésie scellée et remplissez-la de 4 à 5 % d’isoflurane dans 2 L/min d’air médical.
- Lorsque le rat est couché, retirez l’animal de la chambre et placez-le dans un cadre stéréotaxique avec un embout de ventilation approprié.
- Réglez le niveau d’isoflurane à 2 %, bien que le débit d’air doit rester le même. Vérifiez le niveau d’anesthésie. S’il y a une absence du réflexe de retrait de la patte en réponse au pincement, continuez, sinon augmentez la profondeur de l’anesthésie.
- Surveillez et maintenez la température corporelle du rat à 37 ± 0,5 °C à l'aide d'un système de surveillance homéothermique. Appliquez une gouttelette de pommade à la paraffine sur les yeux pour prévenir la dessiccation de la cornée. Répétez cette procédure plusieurs fois pendant la chirurgie, si nécessaire.
- Injecter par voie sous-cutanée 0,3 mg/kg d’atropine pour éviter la formation de mucus dans les voies respiratoires. Pour les chirurgies plus longues, répétez cette opération toutes les quatre heures. Surveillez la respiration et ajustez le vaporisateur, si nécessaire.
4. Implantation des électrodes de stimulation et d’enregistrement
REMARQUE : Autoclavez tous les instruments chirurgicaux nécessaires et suivez attentivement les règles générales de l’asepsie et de l’antisepsie pendant toute la procédure. Évitez de toucher les zones non stériles en dehors de la zone chirurgicale. Immergez les électrodes dans de l’alcool éthylique (70 %) pendant 30 min avant l’implantation.
- Retirez la plupart des cheveux du cuir chevelu à l’aide d’une tondeuse à cheveux. Appliquez la crème dépilatoire sur le cuir chevelu, étalez-la uniformément sur la surface et attendez quelques minutes. À l’aide d’une spatule, retirez délicatement la crème et les cheveux restants. Rincez la peau à l’eau, puis avec un désinfectant.
- Injecter 1 à 2 % de lidocaïne (ne pas dépasser une dose totale de 7 mg/kg) par voie sous-cutanée pour engourdir la peau. Appliquez une seule goutte de pommade vétérinaire pour les yeux (par exemple, de la paraffine).
- Faites une incision sagittale profonde et longue (~2 cm) sur la ligne médiane avec un scalpel du front au cou. Disséquez les tissus, y compris le périoste, du crâne. Ensuite, à l’aide d’un ciseau ou d’une pince à épiler, nettoyez la zone entre les crêtes des deux os temporaux. Rétractez la peau disséquée à l’aide de quatre bouledogues pour garder le crâne exposé.
- Placez délicatement une pince à épiler fine entre le bord raide de l’os temporal et les muscles et séparez-les. Faites des mouvements de jigging pour exposer autant que possible la grande surface de l’os temporal, de préférence du bord de l’os occipital au plan des sutures coronales, sans endommager les muscles.
- Placez les écarteurs deux fois pour garder les os temporaux exposés.
- Rincez la surface du crâne avec 1 à 2 ml de peroxyde d’hydrogène à 3 % (H2O2), puis lavez-le avec 1 à 2 ml d’eau.
- Séchez très soigneusement la surface des os temporaux à l’air, en épongeant l’humidité avec des bâtonnets oculaires. Testez si les électrodes de stimulation s’adaptent à la surface verticale du crâne nettoyée (le bord supérieur de l’électrode de stimulation doit être aligné avec le bord de la crête de l’os temporal). Si nécessaire, réajustez les bouledogues et les écarteurs ou façonnez les électrodes de stimulation avec des ciseaux.
- Remplissez les cavités des électrodes de stimulation avec du gel électroconducteur et mettez une fine couche de colle sur le bord des électrodes.
- Placez l’électrode de stimulation sur la surface sèche de l’os temporal d’un mouvement précis et maintenez-la fermement en place pendant une minute à l’aide d’une pince à épiler. Assurez-vous qu’aucune humidité n’est en contact avec la colle. Épongez avec des bâtonnets oculaires, si nécessaire.
prudence: Si l’électrode devient instable, retirez-la. Après avoir nettoyé l’os, répétez cette étape avec une nouvelle électrode de stimulation.
- Placez du ciment dentaire sur les bords de l’électrode de stimulation, en séchant continuellement l’humidité qui s’échappe dans les tissus avec des bâtonnets oculaires. Ensuite, couvrez toute l’électrode de stimulation avec du ciment.
- Une fois le ciment complètement durci, répétez ces étapes du côté controlatéral.
- Percez des trous sur tout le crâne pour les vis d’ancrage. Enfoncez des vis miniatures dans les trous et mettez du ciment dentaire dessus. Utilisez une tête de perçage de diamètre ~10 % plus petite par rapport au diamètre de la vis.
- Selon le but des expériences, soit souder un connecteur aux extrémités des câbles, le placer sur la surface et le recouvrir de ciment, soit continuer à implanter les électrodes d’enregistrement et les fibres optiques, soit préparer une fenêtre crânienne sur le crâne. Dans ce dernier cas, soudez les connecteurs et n’ancrez-les à la construction qu’à la fin. En cas de besoin d’enregistrements simultanés à long terme TES et LFP, implantez les triplets d’électrodes susmentionnés au lieu de fils simples.
note: Cette configuration permet de supprimer les artefacts de stimulation en mode commun8. Pour plus de détails sur l’enregistrement de l’implantation d’électrodes, voir les protocoles précédents.
- Lavez abondamment les tissus exposés avec un désinfectant. Injecter par voie sous-cutanée 1 à 2 % de lidocaïne (ne pas dépasser une dose totale de 7 mg/kg).
- Débridez les bords de la plaie et fermez-les à l’aide de simples sutures interrompues autour du connecteur/implant. Ensuite, désinfectez la plaie avec de la povidone iodée.
- Injecter 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée. Répétez cette opération si nécessaire.
note: Tout autre analgésique peut être utilisé, répondant aux exigences fixées par le conseil d’autorisation éthique local.
- Suspendez l’anesthésie, relâchez les barres d’oreille et l’embout nasal, et placez l’animal dans une cage de récupération postopératoire pour reprendre conscience.
- Assurez-vous que l’animal est sous étroite surveillance pendant les premières heures postopératoires. Continuez à surveiller périodiquement la zone de l’implant.
note: L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir sa décubitus sternal. Hébergez l’animal individuellement jusqu’à ce qu’il se remette complètement de la procédure.
