1. Fabrication d’électrodes d’enregistrement
- Tirer sur les électrodes en verre
- Utilisez le protocole suivant pour l’extracteur de microélectrodes (voir tableau des matériaux) :
- Ligne 1 : Heat 510 Pull - Vitesse 30 Temps 250 ; Ligne 2 : Heat 490 Pull - Velocity 30 Temps 250.
note: Les unités de temps correspondent à 0,5 ms par unité ; Les autres unités sont relatives. La valeur de la chaleur doit être ajustée pour chaque filament après l’exécution du test de rampe.
- À l’aide d’un microscope (grossissement de 35x), assurez-vous que le diamètre intérieur de l’électrode tirée est compris entre 7 et 10 μm (Figure 1A). Stockez les capillaires dans des récipients hermétiquement fermés pour éviter l’accumulation de poussière.
- Polissage au feu
- Polir au feu les capillaires (80 à 90 % de la valeur thermique maximale pendant 1 à 2 s) à l’aide d’une micro-forge (voir tableau des matériaux). Assurez-vous que le diamètre intérieur final de l’électrode polie est de 5 μm (Figure 1A).
- Pliage
REMARQUE : Deux courbures sont effectuées afin de positionner l’électrode sur le dessus du muscle sous un objectif à fort grossissement.
- Utilisez l’appareil illustré à la figure 1B. Fixez l’électrode dans le manipulateur et positionnez la pointe sur le filament, sans le toucher.
- Réglez la valeur thermique à 60 - 70 % du maximum et appuyez sur la pédale de la micro-forge pendant 1 à 2 s (voir tableau des matériaux) pour chauffer le filament. À l’aide d’une aiguille en forme de L, tirez doucement l’extrémité de l’électrode vers le bas (Figure 1B agrandie). Effectuez le pliage à environ 90° (Figure 1C).
- Tenez l’électrode au-dessus de la flamme de la torche à l’aide d’une pince et effectuez le deuxième pliage à une distance de 7 à 10 mm du premier coude et à un angle d’environ 120o (Figure 1C).
2. Étapes préparatoires supplémentaires
- Préparez une solution semblable à l'hémolymphe (HL3) (en mM) : 70 chlorure de sodium (NaCl), 5 chlorure de potassium (KCl), 20 chlorure de magnésium (MgCl2), 10 hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3), 5 tréhalose, 115 saccharose, 5 acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES) et 1 mM de chlorure de calcium (CaCl2) ; ajustez le pH à 7,3 - 7,4. Conservez la solution au réfrigérateur et faites-la fraîche chaque semaine.
- Fabriquez des pipettes de stimulation de la même manière que les pipettes en verre d’enregistrement, sauf qu’il n’est pas nécessaire de les plier.
note: La préparation des électrodes de stimulation est décrite en détail aux points 28 et 27. Le diamètre final après polissage au feu doit être de l’ordre de 5 à 7 μm.
- Insérez une pipette de stimulation dans un porte-microélectrode relié à une seringue.
3. Enregistrements électriques des courants jonctionnels excitateurs (EJCs)
- enregistrement
- Placez la boîte de Pétri avec la préparation sur la platine du microscope (Figure 2). Insérez l’électrode de référence dans le bain.
- Remplissez l’électrode d’enregistrement avec la solution HL3. Sous l’objectif 10x (voir Tableau des matières), plongez l’électrode dans le bain et placez-la sur les muscles 6 et 7 des segments abdominaux 2, 3 ou 4 à l’aide du micromanipulateur (voir Tableau des matériaux) (Figure 3 A.1 et A.2).
- Passez l’objectif à 60x (voir tableau des matériaux). Concentrez-vous sur la zone d’intérêt à l’aide de l’épifluorescence ou de l’optique DIC. Placez l’extrémité de l’électrode sur le bouton synaptique (Figure 3 B.1-3).
- Appuyez très doucement l’électrode sur le muscle. Une pression excessive peut endommager la jonction neuromusculaire (JNM) ou induire une augmentation de l’activité synaptique spontanée. Assurez-vous que la pointe de l’électrode n’est pas bouchée - si c’est le cas, remplacez-la.
- Allumez l’amplificateur, la carte A/N et l’ordinateur.
- Choisissez le mode de pince de tension sur l’amplificateur.
- Démarrez le logiciel d'acquisition et choisissez le mode « sans espace ».
- Observez l’apparition de courants jonctionnels excitateurs miniatures (mEJCs) sur l’écran de l’ordinateur.
- Assurez-vous que l’amplitude des mEJC est comprise entre 0,2 et 0,7 nA.
note: Des EJC plus petits indiquent que l’électrode d’enregistrement présente des défauts ou qu’elle n’est pas correctement positionnée.
- stimulation
- À l’aide d’un micromanipulateur, sous contrôle visuel, placez l’électrode de stimulation près de l’axone en innervant les segments abdominaux 2 à 4.
- Appliquez une pression négative en tirant sur le piston de la seringue reliée au porte-électrode de sorte que l’axone soit tiré à l’intérieur de l’électrode (Figure 2).
- Allumez le stimulateur. Tournez le bouton de l’unité d’isolation (voir Tableau des matériaux) pour régler un courant zéro, puis augmentez-le doucement jusqu’à ce que des EJC apparaissent (ou jusqu’à ce que le seuil soit atteint).
- Effectuer la stimulation dans un régime supraseuil, avec le courant de stimulation augmenté environ deux fois, par rapport au seuil d’observation des EJCs.
note: D’après notre expérience, une telle intensité de stimulation est optimale pour éviter les défaillances du potentiel d’action et l’activation du potentiel d’action. Par exemple, si les EJC apparaissent à un courant de stimulation de 0,2 mA, utilisez un courant de 0,4 mA tout au long de l’expérience.
