$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Configuration du système
- Construisez l’unité de contrôle de pression.
- Assemblez l’unité de régulation de pression conformément à la carte de circuit (Figure 1). Soudez les pièces nécessaires sur la carte de circuit imprimé (PCB) fabriquée selon les schémas du circuit électrique (Figure 1b). Utilisez des résistances standard, des LED (diodes électroluminescentes), des transistors à effet de champ (MOSFET) à semi-conducteurs à oxyde métallique, des condensateurs et des connecteurs. Souder les électrovannes sur le circuit imprimé (PCB). Connectez la pompe à air et le capteur de pression d’air au circuit imprimé à l’aide d’un fil électrique.
REMARQUE : Une fois que toutes les pièces nécessaires sont disponibles, l’unité de contrôle de la pression doit être construite en 2 heures environ.
- Connectez la carte d’acquisition de données secondaire (DAQ).
- Connectez les sorties de données de la carte de circuit imprimé à la carte DAQ, conformément au Tableau 1.
note: La carte DAQ s’exécute en mode asymétrique. La carte des ports se trouve dans le manuel d’utilisation (voir la Table des matériaux).
- Connectez « AIn Pr S » à l’une des voies d’entrée analogique (AI) et « R-Gr » à l’une des masses analogiques de la carte d’acquisition de données secondaire.
- Connectez la sortie primaire de l’amplificateur à l’une des voies AI et la masse à la masse analogique de la carte d’acquisition de données secondaire.
REMARQUE : Un câble BNC standard peut être utilisé pour connecter la sortie primaire de l’amplificateur.
- Dénudez l’autre extrémité et connectez le signal positif (c’est-à-dire le noyau de cuivre) au canal AI et la terre (c’est-à-dire le fil mince autour du noyau) à la terre analogique. Répétez cette étape pour un deuxième canal si plusieurs canaux de patch sont utilisés.
REMARQUE : L’entrée analogique de la carte d’acquisition de données sera configurée dans les étapes ultérieures.
- Connectez l’alimentation à la sortie d’alimentation de la carte d’acquisition de données secondaire. Utilisez une source d’alimentation 12 V séparée pour la pompe.
- Connectez le tube.
- Connectez la pompe à air et les deux vannes.
- Dans la dernière étape, utilisez un connecteur à 3 voies pour connecter le tube souple de l’orifice supérieur de la vanne 2 au capteur de pression et au porte-pipette.
- Si deux pipettes sont utilisées, ajoutez un autre connecteur à 3 voies dans la tubulure reliée au porte-pipette. Lors du radouchage, basculez manuellement entre les vannes et les pipettes utilisées.
- Installer Autopatcher IG.
REMARQUE : Configuration requise : Autopatcher IG n’a été testé que sur un PC fonctionnant sous Windows 7. Il n’a pas été validé pour d’autres systèmes d’exploitation. La procédure décrite s’applique spécifiquement au matériel répertorié dans la table des matériaux.
- Téléchargez Autopatcher-IG depuis GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
- Installez Python (voir la table des matériaux pour la version et l’adresse de téléchargement).
- Désinstallez la bibliothèque PyQt4 en tapant « pip désinstaller PyQt4 » dans une ligne de commande terminal.
note: Le système utilise une ancienne version de la bibliothèque PyQt4 pour assurer la compatibilité avec les bibliothèques Qwt et Opencv.
- Installez des bibliothèques Python à partir de fichiers de roue historiques (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Trouvez les fichiers suivants : Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) et Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
- Pour installer les fichiers wheel, allez dans le répertoire où les fichiers sont enregistrés et tapez « pip install ***wheelfilename***.whl. » Remplacez « ***wheelfilename*** » par le nom réel du file.
REMARQUE : « cp27 » dans le nom du fichier wheel indique Python 2.7, et « win32 » indique Windows 32 bits. Si « win32 » ne fonctionne pas, essayez « win64 ».
- Pour contrôler la caméra CCD (dispositif à couplage de charge), téléchargez et installez le programme d’installation pour 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). Téléchargez ensuite MicroManager pour 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) pour contrôler la caméra en Python.
- Pour contrôler les manipulateurs et la platine du microscope, installez le logiciel de contrôle fourni par le fabricant.
note: Ce faisant, le pilote nécessaire au contrôle des manipulateurs est également installé. Le package d’installation est généralement fourni dans un CD-ROM.
- Pour contrôler la carte d’acquisition de données secondaire, installez la bibliothèque universelle à partir du CD-ROM fourni avec l’achat de la carte d’acquisition de données.
- Configurez le matériel pour Autopatcher IG.
- Connectez la platine de microscope et les contrôleurs du manipulateur à l’ordinateur via des ports USB.
- Attribuez les numéros de port COM à l’unité 0 : platine de microscope, à l’unité 1 : manipulateur gauche et à l’unité 2 : manipulateur droit, dans cet ordre, dans le fichier de configuration « ports.csv » du dossier « configuration ». Laissez les autres paramètres du fichier ports.csv (c’est-à-dire « SCI » et « 1 ») inchangés.
note: Les informations relatives au numéro de port COM peuvent être trouvées en exécutant le logiciel de configuration du manipulateur fourni par le fabricant. Allez dans l’onglet « Paramètres », sélectionnez « Paramètres » et la page « Mouvement », et lisez les étiquettes de chaque onglet en haut. Vous pouvez également trouver ces informations dans le Gestionnaire de périphériques PC.
- Attribuez des numéros de voie d’entrée analogique sur la carte d’acquisition de données pour un capteur de pression et les voies de brassage 1 et 2 (correspondant aux unités 1 et 2). Entrez le numéro de canal dans le fichier « DAQchannels.csv » dans le dossier « configuration ».
note: Il est recommandé d’ouvrir les fichiers .csv avec l’application Bloc-notes au lieu d’une feuille de calcul, car cela peut modifier les informations lors de l’enregistrement des modifications.
- Exécutez Autopatcher IG.
- Allumez l’amplificateur, le contrôleur du microscope et le contrôleur du manipulateur. Assurez-vous que le logiciel de l’amplificateur est en cours d’exécution.
- Exécutez Autopatcher IG avec Python à partir d’un terminal de ligne de commande comme suit : tout d’abord, changez le répertoire (commande « cd » pour les terminaux les plus courants) où Autopatcher IG est installé, tapez « python Autopatcher_IG.pyw » dans le terminal de ligne de commande et appuyez sur la touche « Entrée
REMARQUE : N’exécutez pas le logiciel de contrôle du manipulateur avant d’exécuter Autopatcher IG car il occupera la platine du microscope et le manipulateur, ce qui empêchera Autopatcher IG de trouver le matériel. Le logiciel de contrôle du manipulateur peut être exécuté après le lancement complet de l’IG Autopatcher s’il y a des modules supplémentaires à contrôler (par exemple, le chauffage en ligne).
- Calibrez la pipette primaire.
- Tirez les pipettes de patch. Remplissez une pipette en verre tiré avec une solution interne et chargez-la sur la tête.
REMARQUE : Les pipettes en verre vides ont des contrastes différents au microscope et peuvent entraîner un étalonnage imprécis.
- Déplacez la pointe de la pipette dans le champ visuel du microscope et faites-la apparaître. Si le pavé numérique est utilisé pour déplacer les manipulateurs et/ou la platine du microscope, mettez à jour les coordonnées en appuyant sur « z » sur le clavier.
note: Cette action n’est pas nécessaire si le clavier (platine de microscope : A/D - axe x, W/S - axe y, R/F - axe z ; manipulateurs : H/K - axe x, U/J - axe y, O/L - axe z, 1/2 - numéro d’unité) est utilisé pour contrôler le mouvement car les coordonnées seront mises à jour en temps réel.
- Cliquez sur le bouton « Démarrer l’étalonnage » sur l’interface utilisateur graphique principale de l’unité correspondante sur laquelle la pipette est chargée (Figure 2).
note: Une fenêtre pop-up apparaîtra lorsque le calibrage sera terminé.
REMARQUE : L’étalonnage sera effectué automatiquement, ce qui prendra environ 3.5 min. Cliquer sur le même bouton (maintenant basculé sur « annuler l’étalonnage » après avoir lancé l’étalonnage) interrompra la tentative d’étalonnage.
- Enregistrez l’étalonnage en cliquant sur « enregistrer l’étalonnage » en bas de l’interface graphique principale (il enregistre l’étalonnage actuel pour les deux manipulateurs et peut être chargé à l’avenir).
REMARQUE : Le champ de vision sous un grossissement faible (4 ou 10X) et élevé (40X) doit être aligné pour que l’étalonnage secondaire fonctionne correctement. Veuillez vous référer au manuel d’utilisation du système optique utilisé pour les procédures d’alignement.
2. Procédure de serrage automatique du patch
- Préparer des coupes de cerveau aiguës
- Préparez des pipettes en verre pour le patch clamp.
- Placez une tranche de cerveau au centre de la chambre d’enregistrement. Stabilisez la tranche à l’aide d’un dispositif de maintien de tranche ou « harpe ».
- Détectez la cellule fluorescente.
- Trouvez la zone d’intérêt sous l’objectif 4X. Déplacez la platine du microscope en activant le mode « cliquer pour déplacer » (« CTM ») et en cliquant sur le centre de la zone d’intérêt. Vous pouvez également utiliser le clavier pour déplacer la platine du microscope (A/D - axe x, W/S - axe y, R/F - axe z).
- Passez à l’objectif à fort grossissement et ajustez la mise au point en déplaçant le microscope sur l’axe z, à l’aide de R/F sur le clavier.
REMARQUE : Il est recommandé d’ajuster le niveau du bain-marie de sorte que le plan focal sous les objectifs à faible et fort grossissement soit identique ou similaire sur l’axe z.
- Cliquez sur le bouton « Détecter la cellule » dans la colonne principale de l’interface graphique, « Unité 0 ». Si la source lumineuse LED ou laser de la configuration ne peut pas être contrôlée par le signal TTL, allumez manuellement la LED/laser ; une fenêtre contextuelle apparaîtra lorsque la détection de la cellule sera terminée.
- Éteignez la LED/laser si nécessaire, une liste de coordonnées de cellule apparaîtra dans l’interface graphique « Positions de mémoire ». Supprimez les cellules indésirables de la liste en cliquant sur le bouton « X » à côté des coordonnées.
- Sinon, si les cellules cibles ne sont pas étiquetées par fluorescence, cliquez sur « Mode souris » dans l’interface graphique principale. Cliquez sur la cellule qui vous intéresse ; un point jaune avec un numéro apparaîtra sur la cellule, et les coordonnées de la cellule apparaîtront dans l’interface graphique « Positions de mémoire ».
- Calibrez la pipette secondaire.
- Remplissez 1/3 d’une pipette en verre avec la solution interne. Chargez la pipette sur le support de pipette fixé à l’étage de tête.
- Utilisez l’objectif à faible grossissement. Amenez la pipette dans le champ visuel et ajustez la mise au point à l’aide du clavier (H/K - axe x, U/J - axe y, O/L - axe z). Utilisez « 1 » et « 2 » pour basculer entre l’unité 1 et l’unité 2.
- Chargez l’étalonnage principal en cliquant sur « Charger l’étalonnage ». Cliquez sur le bouton « Étalonnage secondaire » sur l’interface graphique principale sous l’unité utilisée. Par exemple, si l’unité 2 est utilisée, cliquez sur le bouton « Étalonnage secondaire » dans la colonne « Unité 2 ». Suivez les instructions de la fenêtre contextuelle pour passer à l’objectif à fort grossissement.
- Corrigez une cellule cible.
- Assurez-vous que le logiciel « MultiClamp » (c’est-à-dire l’amplificateur) est en cours d’exécution. Cliquez sur le bouton « Patch control » pour ouvrir l’interface graphique « Patch control » ; l’ouverture de cette interface graphique peut prendre jusqu’à quelques minutes.
- Utilisez l’objectif de grossissement 40X en cochant « 40X » dans la colonne « Unité 0 » de l’interface graphique principale. Cliquez sur le bouton « aller à » à côté de la cellule d’intérêt sur la liste de coordonnées dans l’interface graphique « Position de la mémoire » ; Le microscope se déplacera vers la cellule.
- Cliquez sur le bouton CTM de l’unité utilisée dans l’interface graphique principale pour activer le mouvement après un clic de souris. Cliquez sur la cellule qui vous intéresse ; La pointe de la pipette se déplacera vers la cellule.
- Cliquez sur le bouton « Patch » sur l’interface graphique « Patch control » GUI.
note: Le patching automatique commencera, et la pression et la résistance pourront être surveillées sur l’interface graphique « Patch control ».
- Utilisez le bouton « Unité 1 sélectionnée » pour basculer le signal d’entrée entre les deux unités.
REMARQUE : Le système s’approchera de la cellule cible, appliquera une pression négative, s’adaptera au potentiel de membrane cellulaire et détectera la formation de gigaseal en fonction d’une série de seuils de pression et de résistance et de logique.
- Manipulez le processus automatique à tout moment en cliquant sur les boutons respectifs de l’interface graphique « Patch control ». Par exemple, cliquez à nouveau sur le bouton « Patch » pour annuler l’essai du patch et cliquez sur « Étape suivante » pour faire passer le processus de patching à l’étape suivante, quel que soit le threshold.
REMARQUE : Une fenêtre contextuelle informera l’utilisateur lorsqu’un gigaseal s’est formé, et l’option d’appliquer zap avec une grande pression négative sera présentée.
- Sélectionnez « Oui » pour roder avec une combinaison de zap et d’aspiration. Vous pouvez également sélectionner « Non » pour roder avec aspiration uniquement.
REMARQUE : Lorsqu’un correctif de cellule entière est terminé, une fenêtre contextuelle rappelle à l’utilisateur d’enregistrer le journal des correctifs de l’expérience.
- Enregistrez le correctif de l’expérience.
REMARQUE : Si un essai de correctif échoue, une fenêtre contextuelle en informera l’utilisateur et le processus de correctif sera réinitialisé.
- Revenez à l’étape 2.4 et répétez les étapes avec une autre cellule.