Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la solution de perfusion et des composés d’essai
- Préparez 5 L de solution de Krebs : 113 mM de chlorure de sodium, NaCl, 5,9 mM de chlorure de potassium, KCl, 1,2 mM de phosphate de dihydrogène, NaH2PO4, 1,2 mM de sulfate de magnésium, MgSO4, 25 mM de bicarbonate de sodium, NaHCO3, 1,2 mM de chlorure de calcium, CaCl2 et 11,5 mM de glucose. Saturez la solution d’un mélange gazeux à 95 % d’O2 + 5 % de CO2. Pré-refroidir ~500 ml de Krebs oxygénés au réfrigérateur.
- Préparer au besoin des aliquotes des composés d’essai (1 mM de capsaïcine dans l’éthanol et 10 mM de 5-hydroxytryptamine (5-HT) dans une solution saline). Diluer le stock dans des Krebs (pour une application en bain) et dans une solution saline (pour une administration intraluminale) jusqu’à la concentration finale juste avant l’utilisation.
2. Préparation de l’électrode d’enregistrement
- Tirez l’électrode d’enregistrement à partir de tubes en verre standard sans filaments intérieurs (1,5 mm de diamètre extérieur) à l’aide d’un extracteur d’électrode conventionnel. Ajustez les paramètres de l’extracteur pour la chaleur et la traction de manière à ce que la tige des électrodes tirées soit comprise entre 20 et 25 mm.
3. Prélèvement de tissus
- Anesthésier le rat en profondeur à l’aide de pentobarbital sodique (80 mg/kg, i.p.).
- Tout en assurant la stérilité, exposez la cavité abdominale en effectuant une incision médiane sur la paroi abdominale à l’aide d’un scalpel. Écartez le mésentère et les autres tissus pour exposer le colorectum.
- Placez l’animal sous le microscope à dissection. Grâce à une dissection soigneuse, localisez le ganglion pelvien gauche (PG) et identifiez les nerfs pelviens (PN) et les nerfs splanchniques lombaires (LSN) qui le rejoignent. Coupez ces nerfs à quelques millimètres du PG.
note: Le PG se trouve près de la jonction colorectale. Typiquement, 3 à 4 PN de la moelle épinière lombo-sacrée et un projet LSN vers le PG (Figure 1).
- Coupez l’os de la symphyse pour exposer le rectum. Retirer les tissus (c.-à-d. la vessie, etc.) au-dessus du colorectum ; veillez à ne pas laisser le PG intact.
- Sacrifiez le rat par l’injection intraveineuse d’une surdose de pentobarbital. Transectez le côlon à environ 3 cm au-dessus du PG et retirez le colorectum de l’animal à l’aide d’une pince.
- Transférez le colorectum dans une boîte de Pétri remplie de solution de Krebs pré-refroidie. Retirez les matières fécales en rinçant doucement le côlon. Retirez le reste de la vessie et des autres tissus avec soin, sans compromettre le PG.
4. Dissection des nerfs afférents du côlon
- Placez le côlon dans une chambre d’enregistrement (20 ml) et perfuser le tissu en continu avec une solution de Krebs carbogénée. Réglez le débit de perfusion à 15 mL/min.
- Canuler le colorectum aux extrémités buccale et anale. Commencer la perfusion intraluminale du côlon avec une solution saline à un débit de 10 mL/h dans le sens oral à anal.
- Localisez le PG majeur sous le microscope de dissection. Utilisez des épingles à insectes pour exposer le ganglion. Avec une dissection soigneuse, trouvez une fine branche de nerf émanant du ganglion et allant vers le côlon (Figure 1). Coupez le nerf près du ganglion.
REMARQUE : La figure 1 illustre un enregistrement d’une branche nerveuse distale vers le PG. Le nerf contient probablement un mélange de fibres afférentes splanchniques pelviennes et lombaires. Alternativement, un enregistrement peut être effectué à partir du PN et/ou du LSN proximal au PG.
- Allumez le bain chauffant et réchauffez la solution de Krebs pour maintenir la température de la chambre à 34 ± 0,5 °C.
5. Préparation de l’électrode d’aspiration
- Prenez une pipette en verre pré-tirée (étape 2) et inspectez-la au microscope à dissection. Cassez l’extrémité de l’électrode à l’aide d’une paire de pinces pour qu’elle soit d’une taille compatible avec le diamètre du nerf à enregistrer.
- Biseautez la pointe en la plaçant près d’un évasement plus léger.
6. Enregistrement électrophysiologique
- Connectez l’électrode biseautée au porte-électrode. Connectez une seringue de 10 ml à l’orifice latéral du support pour appliquer une pression négative ou positive sur l’électrode.
- Connectez le support à la tête du bioamplificateur et montez la tête sur un manipulateur.
- Déplacez l’électrode dans le bain de tissu et remplissez l’électrode avec la solution de Krebs en appliquant une légère aspiration jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec le fil d’argent du support. Placez l’extrémité de l’électrode près de l’extrémité coupée du nerf et appliquez une pression négative pour aspirer le nerf dans l’électrode. Appliquez plus de pression négative de sorte que ~1 mm du nerf soit tiré dans l’électrode et forme un joint étanche.
- Allumez le bioamplificateur et réglez le filtre sur 300 - 3 000 Hz. Surveillez le signal sur l’oscilloscope et enregistrez le signal nerveux (fréquence d’échantillonnage de 20 kHz) et le signal de pression intraluminale (fréquence d’échantillonnage de 100 Hz) à l’aide d’un ordinateur doté d’un logiciel de traitement des données de pointe.
7. Test de la sensibilité afférente du côlon
- Appliquez une distension de rampe du côlon en fermant le robinet à trois voies sur la canule de sortie tout en perfusant continuellement par voie intraluminique. Surveillez la pression intraluminale jusqu’à ce qu’elle atteigne 60 mmHg, puis ouvrez le robinet à trois voies sur la canule de drainage.
