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1. Ensemencer et traiter des cellules endothéliales vasculaires cérébrales (CVE) sur des plaques de culture cellulaire
- Amorcer des cellules CVE (cellules bEnd.3) sur une plaque de culture cellulaire à flux extracellulaire de 96 puits : 80 μL/puits. Placez la plaque de culture cellulaire à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Remarque : 16 × 103 cellules par puits atteindront 60 à 80 % de confluence en 24 heures.
- Si les cellules sont exposées à un produit chimique, ajoutez les traitements une fois que les cellules sont fixées au fond de la plaque (8 à 24 heures après l’ensemencement).
note: Pour les expériences de transfection, n’ajoutez pas d’antibiotiques dans un milieu de croissance complet.
2. Évaluation de la fonction mitochondriale à l’aide du bioanalyseur
- Avant le début de l’essai, hydrater une cartouche de capteur de flux extracellulaire avec un calibrateur en ajoutant 150 μL de solution de calibrate de flux extracellulaire sur la plaque et en incubant pendant une nuit à 37 °C sans CO2.
- À l’aide de la station de lavage de plaques, transformez le milieu de culture cellulaire en milieu d’essai de flux extracellulaire pH 7,0. Incuber les cellules à 37 °C sans CO2 pendant 30 à 60 min.
- Préparez des solutions de travail d'oligomycine 8 μM, de 4,5 μM de carbonilcyanure 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), de roténone 10 μM et d'antimycine A 10 μM dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Charger 25 μL des solutions mères dans les orifices d’injection de la cartouche : Orifice A, oligomycine ; Port B, FCCP ; Port C, roténone et antimycine A avec milieu de dosage du flux extracellulaire. Mettre en œuvre le protocole d’analyse décrit dans le tableau 1.
- Chargez la cartouche hydratée dans le bioanalyseur et effectuez l’étalonnage en cliquant sur le bouton « Démarrer ». Une fois l’étalonnage terminé, retirez la plaque inférieure de la cartouche et chargez la plaque de cellule en cliquant sur l’invite « Décharger la cartouche ». Poursuivez le dosage jusqu’à ce que toutes les mesures soient terminées.
- Ouvrez le fichier de données et obtenez les valeurs de débit à partir du bioanalyseur. Exportez les données dans un fichier tableur.
Table 1. Le protocole d’exécution de l’instrument.
