Enregistrement de l’activité du nerf afférent mésentérique dans un segment de jéjunum de souris ex vivo

Résumé

Source : Nullens, S., et al. Enregistrement in vitro de l’activité du nerf afférent mésentérique dans les segments jéjunal et colique de souris. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo montre le processus d’enregistrement des signaux électriques des nerfs afférents mésentériques dans un segment jéjunal de souris disséqué afin d’étudier les effets de la pression tissulaire et des changements de mouvement sur l’activité des nerfs afférents.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation du nerf afférent jéjunal

1. Effectuer l’euthanasie chez un rongeur adolescent ou adulte qui a été approuvée avant l’expérience par le comité d’éthique local (p. ex., sédation terminale suivie d’une ponction cardiaque, d’une luxation cervicale, etc.).
   note: Nous avons utilisé la luxation cervicale pour sacrifier les animaux, ce qui a permis de réaliser des expériences sans avoir besoin d’anesthésie supplémentaire ou de soins post-chirurgicaux, car les tissus sont traités in vitro.
   note: Il a été démontré que l’âge atténue les fonctions mécanosensorielles afférentes mésentériques, nous conseillons donc aux chercheurs d’adhérer à un groupe d’âge spécifique pour la durée d’une seule expérience.
2. Placez l’animal de laboratoire sacrifié en position couchée et effectuez une incision abdominale médiane à travers la peau et la couche musculaire abdominale à l’aide d’un scalpel, s’étendant de l’apophyse xiphoïde jusqu’à l’os pubien.
3. Baigner la cavité abdominale avec une solution froide de Krebs afin d’éviter le dessèchement des tissus intra-abdominaux (composition de Krebs : 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH₂PO₄, 15,43 mM NaHCO₃, 1,21 mM MgSO₄, 11,52 mM D-glucose et 1,52 mM CaCl₂).
4. Excisez rapidement tout le jéjunum à l'aide de ciseaux tranchants en excisant environ 20 cm de l'intestin grêle en commençant immédiatement distalement de la flexion duodénojéjunale, en prenant soin de ne pas endommager les structures environnantes et en gardant intact le mésentère de l'intestin, qui contient les vaisseaux sanguins jéjunaux et les nerfs afférents.
   note: Pour la simple dissection jéjunale dans la cavité abdominale, il n’est pas nécessaire d’utiliser un stéréomicroscope, car cela peut être facilement visualisé à l’œil nu.
5. Placez le jéjunum excisé dans une solution de Krebs glacée et conservez-le sur de la glace tout en oxygénant continuellement la solution de Krebs avec du carbogène (95 % O₂, 5 % CO₂).
6. Coupez le jéjunum avec des ciseaux tranchants en boucles d’environ 3 cm de long. Observez le faisceau mésentérique contenant les vaisseaux et le nerf splanchnique quelque part près du centre de l’anse respective.
7. Rincez chaque segment avec la solution de Krebs à l’aide d’un cathéter émoussé pour éliminer le contenu luminal et le chyme, car ceux-ci contiennent des enzymes digestives qui accéléreront la détérioration de l’échantillon de tissu in vitro.
   note: Veillez à ne pas endommager la lumière de l’anse pendant le rinçage, car la destruction des villosités entraînera la libération de médiateurs qui peuvent modifier l’activité nerveuse afférente.
8. Identifiez le segment pour mesurer l’activité nerveuse afférente (par exemple, le premier segment jéjunal distalement du ligament de Treitz ou la flexion duodénojéjunale), et placez-le dans une chambre d’enregistrement spécialement conçue et recouverte d’une couche d’élastomère de silicone.
   note: Le début du jéjunum est anatomiquement défini comme la partie de l’intestin grêle où le ligament de Treitz traverse l’intestin grêle, également appelée flexion duodénojéjunale.
   note: Couvrez le fond de la chambre d'enregistrement avec une fine couche d'élastomère de silicone bien avant le début de l'expérience. Préparez cette couche d'élastomère selon les instructions du fabricant.
9. Perfuser constamment la chambre avec une solution chaude de Krebs carbogéné à raison de 10 ml/min et maintenir la température de Krebs dans la chambre d'enregistrement constante à 34 °C.
10. Montez le segment jéjunal dans le bain d’organe de sorte que l’extrémité orale soit connectée au tourne-seringue fournissant un flux luminal, et que l’extrémité aborale se connecte à l’écoulement sortant. Étirez légèrement le segment mais veillez à ne pas exercer de tension excessive. Fixez fermement les deux extrémités à l’aide de ligatures en soie 4/0 aux orifices d’entrée et de sortie.
11. Fixez le pousse-seringue à l’extrémité orale et perfuser le segment jéjunal par voie intraluminale avec la solution de Krebs (non oxygénée, température ambiante) à raison de 10 ml/h.
12. À l’aide d’épingles à insectes, le mésentère du segment intestinal monté est fixé à plat contre la couche inférieure en élastomère de silicone. Étirez le mésentère pour optimiser la visualisation du faisceau mésentérique ; N’exercez pas de tension sur le faisceau ou le jéjunum.
13. Effectuez une distension de rampe d’essai (voir ci-dessous) en fermant l’orifice de sortie jusqu’à ce que la pression intraluminale du segment intestinal atteigne 60 mmHg pour vérifier qu’aucune solution de Krebs intraluminale ne s’échappe du segment monté. Observez une augmentation douce de la pression intraluminale sans interruption.
14. Observer les petites contractions du segment (ondes péristaltiques) pendant la phase de distension initiale. Si nécessaire, bloquez l’activité péristaltique en ajoutant 1 μM de nifédipine, un inhibiteur calcique de type L, à la solution de Krebs.
    note: L’ajout de 1 μM d’atropine à la solution de Krebs en plus de la nifédipine paralysera complètement le segment intestinal.
15. Sous un stéréomicroscope, commencez doucement à décoller le tissu adipeux du mésentère en le tirant doucement avec deux petites pinces à épiler, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux et le nerf afférent qui se trouvent enfouis dans le tissu adipeux.
16. Commencez à une distance éloignée du jéjunum et exposez les deux vaisseaux sanguins du faisceau mésentérique.
17. Observez le nerf jéjunal afférent entre les deux vaisseaux comme un mince fil blanc encapsulé dans le tissu adipeux. Ne disséquez plus proximal vers le jéjunum qu’en décollant doucement le tissu adipeux à l’aide d’une pince à épiler lorsque l’identification initiale des vaisseaux mésentériques et/ou du nerf afférent est difficile.
18. Disséquez le nerf mésentérique jéjunal du segment libre sur une distance de plusieurs millimètres, en retirant le tissu adipeux adhérent au nerf.
19. Transectez le nerf à l’aide de ciseaux à tissus tranchants. Si nécessaire, décollez la graisse et le tissu conjonctif restants, ainsi que la gaine épineuronale, en tirant doucement avec la petite pince à épiler.
20. À l’aide d’un micromanipulateur, abaissez l’extrémité de l’électrode d’aspiration, reliée à une seringue à l’aide d’un piston, dans le bain d’organe, puis, en manipulant le piston, aspirez doucement un peu de solution de Krebs du bain d’orgue de sorte que l’extrémité de l’électrode soit immergée dans la solution de Krebs (Figure 1). Assurez-vous que la solution Krebs recouvre le fil-électrode à l’intérieur de l’électrode d’aspiration.
    note: À l’aide d’un extracteur de pipette, préparez le capillaire d’aspiration en verre borosilicaté contenant le fil-électrode avant le début de l’expérience.
21. Positionnez l’extrémité de l’électrode d’aspiration immédiatement à côté du brin de nerf afférent transecté et tirez le brin de nerf transecté dans le capillaire sur toute sa longueur.
22. Manœuvrez l'extrémité de l'électrode vers du tissu adipeux et aspirez-le dans le capillaire en verre tout en aspirant fermement avec le piston, scellant ainsi mécaniquement le nerf du capillaire du contenu du bain d'organe.
23. Vérifiez l’enregistrement de l’activité du nerf afférent à l’aide du système d’acquisition de données, par exemple en effectuant une augmentation de la décharge afférente induite par la distension de rampe (voir ci-dessous). Après l’isolement du nerf dans l’électrode d’aspiration, stabiliser la préparation pendant 15 minutes afin d’obtenir un état stable d’activité nerveuse afférente spontanée avant d’effectuer les expériences proprement dites.
24. Pour effectuer une distension sur rampe, distendez le segment intestinal en fermant l’orifice de sortie, ce qui entraîne une augmentation progressive de la pression (jusqu’à 60 mmHg). N’exécutez le protocole expérimental souhaité que lorsque trois distensions de rampe consécutives (avec un intervalle de 15 minutes) produisent une décharge multi-unités reproductible (Figure 2).

Résultats

Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de la chambre d’enregistrement et de l’électrode d’aspiration spécialement conçues. Vue d’ensemble détaillée de la configuration technique avec l’électrode d’aspiration et la chambre d’enregistrement en place.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure de sodium (NaCl)	Produits chimiques VWR	2,78,10,295	solution composée de Krebs
Chlorure de potassium (KCl)	Acros organics	196770010	solution composée de Krebs
Dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4)	Produits chimiques VWR	1,06,34,61,000	solution composée de Krebs
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Merck	1,06,32,91,000	solution composée de Krebs
Sulfate de magnésium (MgSO4)	Merck	1,05,88,61,000	solution composée de Krebs
Chlorure de calcium (CaCl2)	Merck	2,38,11,000	solution composée de Krebs
D-glucose	Produits chimiques VWR	Référence 1011175P	solution composée de Krebs
eau distillée			solution composée de Krebs
Tubes en PVC	Fournitures de laboratoire scientifique		Le segment intestinal doit être monté sur un tube en PVC
Tubes en silicone	Fournitures de laboratoire scientifique		Le reste du tube, idéalement à base de silicone, permet de déloger plus facilement les débris dans le tube
Fil de soie	Pearsall Limited	10B15S220	Fixation du segment sur le tube en PVC
Tourne-seringue	Appareil de Harvard	Référence 55-2222	Infusion intraluminale de Krebs
Jumelles - y compris grossissement 10x dans oculair	Zeiss STEMI 2000		Visualisation optimale pour la dissection du nerf afférent
Unité de commande de couverture homéothermique	Appareil de Harvard	507214	Chauffage de la chambre de l’orgue
Bain d’orgue sur mesure avec fond recouvert de Sylgard
Logiciel Spike2			Enregistrement et analyse des données
Épingles à insectes, 500 pièces, acier inoxydable, diamètre 0,2 mm	Austerlitz épingles à insectes minutiens		Dissection du nerf afférent
Pince à épiler Dumont #5 inox 11cm	Instrument de précision mondial	500341	Dissection du nerf afférent
Ciseaux, ressort, 14 cm	Instrument de précision mondial	Référence 15905	Dissection du nerf afférent
Digitimer de base de données	NL 108T2/10		Transducteur de pression
Micromanipulateur	Narishige	M-3333	Manipulation 3D de l’électrode d’aspiration
Micromanipulateur	Bloc rotatif X-4		Manipulation 3D de l’électrode d’aspiration
Micromanipulateur	Support magnétique GJ-8		Manipulation 3D de l’électrode d’aspiration
Source de lumière	Microscopes Euromex Holland EK-1		Visualisation optimale pour la dissection du nerf afférent
CED 1401 Appareil d’enregistrement			Enregistrement de l’activité du nerf afférent
Humbug 50/60Hz Éliminateur de bruit	Quest Scientific Instruments		Élimination du bruit de fond
Pompe à perfusion	Gibson Minipuls 2		Infusion de la chambre de l’organe dans laquelle le segment est monté
Porte-microélectrode demi-cellules 1,5 mm	Instrument de précision mondial	MEH2SW	Électrode d’aspiration pour l’isolation de la fibre afférente
Capillaires en verre borosilicaté, 300 pièces ; 1,5/0,84 OD/ID	Instrument de précision mondial	1B150-4	Capillaire pour l’isolement du nerf afférent