Mise en place d’une pince de patch de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique à partir de neurones sensoriels voméronasaux

Résumé

Source : Ackels, T., et al. Analyse physiologique approfondie de populations cellulaires définies dans des coupes de tissus aigus de l’organe voméronasal de la souris. J. Vis. Exp. (2016)

La vidéo du protocole décrit la mise en place d’un patch clamp de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique des neurones sensoriels de l’organe voméronasal (VNO) chez la souris. Une tranche coronale de VNO avec des neurones sensoriels marqués par fluorescence est placée dans une configuration d’enregistrement. Un neurone marqué est patché à l’aide d’une pipette d’enregistrement dans une configuration de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique en réponse à des stimuli chimiques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Préparation de la solution

1. Préparer la solution extracellulaire tamponnée S₁ : 4-(2-hydroxy-éthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) solution extracellulaire tamponnée contenant (en mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES ; pH = 7,3 (ajusté avec NaOH) ; osmolarité = 300 mOsm (ajusté avec le glucose).
2. Préparer la solution extracellulaire S₂ : solution extracellulaire oxygénée au carbogène (95 % O₂, 5 % CO₂) contenant (en mM) 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgSO₄, 5 acide bis(2-hydroxyéthyl)-2-aminoéthanesulfonique (BES) ; pH = 7,3 ; osmolarité = 300 mOsm (ajustée avec le glucose).
3. Préparer une solution d’agarose à 4 % à basse température de gélification (S₃) pour l’enrobage dans les tissus : agarose à 4 % à basse température de gélification. Dissoudre 2 g d’agarose peu gélifiante dans 50 ml de_S1 dans un flacon de laboratoire en verre de 100 ml avec un agitateur magnétique. Pour faire fondre l’agarose, mettez la bouteille dans un bain-marie (avec le couvercle non hermétiquement fermé) à 70 °C pendant environ 20 minutes ou jusqu’à ce que la solution devienne transparente en remuant. Refroidir et conserver l’agarose fondue dans un deuxième bain-marie à 42 °C jusqu’à nouvel ordre.
4. Préparer la solution intracellulaire S₄ : Solution pipette contenant (en mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA), 0,3 CaCl₂ (Ca²⁺ libre = 110 nM), 10 HEPES, 2 sel d’adénosine 5'-triphosphate de magnésium (MgATP), 1 sel de sodium 5'-triphosphate de guanosine (NaGTP) ; pH = 7,1 (ajusté avec KOH) ; osmolarité = 290 mOsm.
5. Modifier/ajuster la composition de S₁, S₂ et S₄ en fonction de la conception expérimentale individuelle (par exemple, des bloqueurs pharmacologiques pour isoler certains types de courants activés par la tension).

2. Dissection et intégration VNO

1. Sacrifiez l’animal en l’exposant brièvement au CO₂ et décapitez-le à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants. Remarque : Comme il est essentiel de s’écouler un temps entre le sacrifice de l’animal et la mise en place de la capsule de VNO sur la glace, réduisez le temps à moins de 2 minutes. Pour maintenir la viabilité des tissus, intégrez les deux VNO entièrement disséqués dans l’agarose en moins de 30 min.
2. Retirez la mâchoire inférieure avec de gros ciseaux chirurgicaux. Entrez par la cavité buccale et coupez les os de la mandibule et les muscles de chaque côté séparément.
3. Placez la partie restante de la tête à l’envers dans la grande boîte de Pétri.
4. Retirez la peau de la mâchoire supérieure et autour du bout du nez avec une pince moyenne pour mieux accéder aux incisives.
5. À l’aide de ciseaux à os, coupez la plus grande partie des incisives à un angle de ~45° dans la direction rostrale (figure 1A). Cela facilitera le retrait de la capsule VNO de la cavité nasale.
   note: Ne coupez pas jusqu’à la racine de la dent pour éviter d’endommager l’extrémité de la capsule VNO.
6. Saisissez le palais supérieur rigide par sa partie rostrale à l’aide d’une pince moyenne et retirez-le soigneusement en un seul morceau à un angle plat (Figure 1B).
   note: Rincer à plusieurs reprises avec du S₂ glacé.
7. Utilisez des micro-ciseaux à ressort pour couper la fusion osseuse entre la pointe de l’os vomer et la mâchoire. Insérez les pointes des ciseaux avec la partie incurvée de la pointe pointant vers l’extérieur loin du VNO et coupez soigneusement l’os par petites étapes sur les côtés gauche et droit de la capsule VNO.
8. Pour retirer la capsule VNO, utilisez des ciseaux à micro-ressort pour couper l’os vomer au niveau de la partie caudale et soulevez soigneusement l’os vomer hors de la cavité nasale à l’aide d’une pince moyenne. Transférez immédiatement le VNO dans une petite boîte de Pétri sous un stéréomicroscope sur un pack de gel glaciaire où les étapes restantes de la dissection seront effectuées.
9. Rincez le VNO dans une petite quantité de_S2 glacé pour éviter que le tissu ne se dessèche.
10. Séparez les capsules cartilagineuses qui contiennent les tissus mous VNO en saisissant l’arrière de l’os vomer avec une pince moyenne. Positionnez la capsule pour une vue dorsale de sorte qu’une scission entre les deux VNO devienne visible (Figure 1D_i).
11. À l’aide de la pointe d’une pince fine, séparez les deux capsules de cartilage VNO de l’os central tout en maintenant l’os vomer fixé à l’arrière><. note: Utilisez des pinces uniquement sur le bord de la capsule cartilagineuse et faites très attention à ne pas percer le cartilage car l’épithélium sensoriel délicat est facilement endommagé.
12. Une fois que les deux VNO sont séparés, commencez à retirer le cartilage encapsulant le premier VNO.
13. Saisissez le bord supérieur de la capsule à l’aide d’une pince fine et séparez la paroi cartilagineuse qui était précédemment attachée à l’os vomer (côté médial).
14. Pour enlever le cartilage restant, tournez le VNO avec son côté latéral incurvé vers le fond de la boîte et fixez solidement le cartilage d’un côté à l’aide d’une pince. Déplacez avec précaution la deuxième pince fine de l’arrière à un angle très plat entre le cartilage et le VNO pour desserrer la connexion entre le tissu et le cartilage.
15. Retirez lentement le VNO du cartilage en le tenant à son extrémité caudale, pour éviter d’endommager l’épithélium sensoriel.
16. Une fois que le VNO est retiré de la capsule, assurez-vous de retirer toutes les petites parties de cartilage restantes, car les morceaux de cartilage restants détacheront le tissu de l’agarose environnante pendant le processus de tranchage.
17. Placez une petite goutte de S₂ glacé sur le premier VNO disséqué pour éviter d’endommager les tissus. Un gros vaisseau sanguin sur la face latérale deviendra visible, indiquant que l’organe est toujours intact et n’a pas été gravement endommagé lors de la dissection (Figure 2A_ii). Si le vaisseau sanguin est endommagé, il sera toujours utile de continuer à trancher le VNO tant que la morphologie globale n’a pas été clairement altérée.
18. Disséquez immédiatement le deuxième VNO.
19. Pour encastrer les VNO, remplissez les deux petites boîtes de Pétri jusqu’au bord avec du S₃ fondu (stocké dans un bain-marie à 42 °C ; voir 1.3).
20. Tenez le VNO sur l’extrémité caudale la plus large avec des pinces fines pour éviter d’endommager l’épithélium sensoriel.
21. Immergez le VNO dans l’agarose et déplacez-le horizontalement d’avant en arrière plusieurs fois pour retirer le film de solution extracellulaire ainsi que toutes les bulles d’air de sa surface.
22. Positionnez le VNO verticalement avec l’extrémité caudale face au fond de la parabole. Au lieu de pincer directement le VNO avec la pince, ajustez l’orientation en déplaçant la pointe de la pince à proximité du VNO.
    note: L’orientation lors de l’intégration est cruciale car elle détermine le plan de coupe et l’accessibilité aux neurones sensoriels pendant l’expérience.
23. Placez la vaisselle sur un bloc réfrigérant et attendez que l’agarose se soit solidifiée.
    Remarque : Ne changez pas l’orientation VNO une fois que l’agarose a commencé à se solidifier, car cela détacherait le tissu de l’agarose environnante.

3. Découpage des tissus coronaux VNO

1. À l’aide d’une petite spatule, retirez le bloc d’agarose du petit plat dans le couvercle d’une grande boîte de Pétri, retournez l’agarose en laissant l’extrémité caudale du VNO vers le haut.
2. Découpez le bloc en forme pyramidale à l’aide d’un scalpel chirurgical (3-4 mm à la pointe, 8-10 mm en bas). Veillez à ne pas endommager les tissus incrustés.
3. Utilisez de la super colle pour fixer le bloc en forme de pyramide au centre de la plaque d’échantillon du vibratome et attendez ~1 min pour que la colle sèche complètement.
4. Transférez la plaque d’échantillon dans la chambre de tranchage et préparez le deuxième VNO en conséquence. Maintenir la plaque avec le deuxième échantillon à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
5. Utilisez un microtome à lame vibrante avec les réglages suivants : épaisseur : 150-200 μm ; vitesse : 3,5 u.a. = 0,15 mm/s ; fréquence : 7,5 u.a. = 75 Hz. Transférez les tranches dans la chambre d’oxygénation jusqu’à utilisation après avoir brièvement inspecté la morphologie des tranches au microscope de dissection. Les tranches peuvent être conservées pendant plusieurs heures.

4. Enregistrements électrophysiologiques à cellule unique

1. Pour les enregistrements, utilisez un microscope à platine fixe droit équipé d’objectifs à immersion dans l’eau, de Dodt ou de contraste interférent différentiel infrarouge (IR-DIC) et d’épifluorescence, ainsi qu’une caméra CCD (dispositif à couplage de charge refroidi). Pour l’acquisition de données, utilisez un amplificateur patch-clamp, un étage de tête, une carte d’interface analogique-numérique/numérique-analogique (AD/DA) et un ordinateur (y compris un logiciel d’enregistrement).
2. Préparez un stock de 10 à 20 pipettes patch (4 à 7 MΩ). Tirez des pipettes de capillaires en verre borosilicate (1,50 mm de diamètre extérieur [OD]/0,86 mm de diamètre intérieur [ID]) à l’aide d’un extracteur de micropipette et polissez au feu avec un microforge.
   note: Le polissage au feu des pointes de pipette est crucial lors du patchage des VSN plutôt petits. Cela aidera à éviter la rupture de la membrane cellulaire lors de l’application d’une pression négative afin d’obtenir une étanchéité à haute résistance. Après le polissage, l’ouverture de la pipette doit être d’environ 1 μm.
3. Conservez les pipettes dans un bocal de stockage des pipettes pour éviter les dommages et l’accumulation de poussière jusqu’à l’utilisation.
4. Préparer le système de perfusion en remplissant les réservoirs de solution et les tubes conformément au plan expérimental.
   note: Retirez complètement les bulles d’air du tube car elles interféreront fortement avec les enregistrements électrophysiologiques.
5. Ajustez la pression pour atteindre un débit de ~3 ml/min.
   note: Des pressions élevées provoqueront le mouvement de la tranche de tissu ainsi que l’arrêt des enregistrements électrophysiologiques.
6. Transférez la tranche VNO dans la chambre d’imagerie et fixez-la à l’aide d’un ancrage en acier inoxydable câblé avec des fibres synthétiques de 0,1 mm d’épaisseur (Figure 2B-C).
   note: Ne couvrez pas la tranche de tissu avec l’un des fils de fibres synthétiques, mais plutôt l’agarose qui entoure la tranche.
7. Transférez la chambre d’imagerie vers la configuration d’enregistrement et superfusionnez en continu la coupe avec du S₂ oxygéné à température ambiante via une application de bain.
8. Ajustez le capillaire d’aspiration à la surface de la solution pour créer une aspiration lente pour un échange constant de la solution de bain. Ajustez le « crayon de perfusion » à barillets multiples 8 en 1 au-dessus et à proximité de la partie non sensorielle de la tranche VNO qui contient le vaisseau sanguin (figures 2C, 3A). Il sera bénéfique de disposer le crayon de perfusion et la pipette d’enregistrement pour faire face à la tranche dans des directions opposées.
9. Connectez l’électrode de référence et la solution de bain à l’aide d’un pont gélosé en forme de L (rempli de 150 mM de KCl).
10. Remplir la pipette patch avec la solution de pipette S₄.
11. Montez la pipette sur l’électrode patch recouverte de chlorure d’argent connectée à l’étage de tête sans gratter le revêtement et fixez-la fermement.
12. Appliquez une légère pression positive (environ 1 ml sur une seringue en plastique de 10 ml) sur la pipette patch avant d’entrer dans le bain.
13. Abaissez la pipette dans le bain à l’aide de micromanipulateurs suffisamment éloignés pour pouvoir immerger l’objectif sans le heurter (Figure 2D).
14. Surveiller la résistance de la pipette (_{R pip}, entre 4 et 7 MΩ) à l’aide d’un logiciel d’électrophysiologie connecté à l’étage de tête.
    note: Si le_point R est de <4 MΩ, la pointe du verre est cassée. Si le _tuyau R est >10 MΩ, la pointe est probablement bouchée et la pipette doit être remplacée.
15. Visualisez la coupe VNO avec une caméra CCD à l’aide d’un contraste interférentiel différentiel (DIC) optimisé pour l’infrarouge et identifiez les cellules exprimant FPR-rs3-i-Venus (FPR-rs3 : séquence 3 liée au récepteur du peptide de formyle) exprimant des cellules (ou des neurones marqués de manière similaire) à l’aide d’un éclairage de fluorescence et d’un cube de filtre approprié.
16. Focaliser et cibler des cellules fluorescentes ou non fluorescentes selon la conception expérimentale.
17. Pour vous approcher du corps cellulaire, utilisez des volants pour une sensibilité maximale. En raison de la pression positive, une petite bosse dans la membrane du soma cellulaire devient visible une fois que la pointe de la pipette est à proximité.
18. Relâchez la pression positive et appliquez une légère pression négative pour aspirer la membrane cellulaire afin d’obtenir une étanchéité à haute résistance (1-20 GΩ). Appliquez une aspiration courte et douce pour perturber la membrane cellulaire et établir la configuration de la cellule entière.
19. Surveillez en permanence la résistance d’accès pendant l’expérience.
    note: N’incluez que les neurones présentant une résistance d’accès petite et stable (≤3 % de_l’entrée R ; changement <20 % au cours de l’expérience) dans l’analyse.

Résultats

Figure 1 : Dissection du VNO. (A) Vue latérale sur la tête de la souris pour illustrer la position et l’angle auxquels les incisives sont coupées. (B) Vue ventrale représentant le meilleur point pour saisir et décoller le palais supérieur (UP). (C) Vue ventrale de la capsule cartilagineuse (CC) qui abrite le VNO et l’os vomer (VB) après l’abla...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Produits chimiques
Agarose (basse température de gélification)	PeqLab	35-2030
ATP (Mg-ATP)	Sigma-Aldrich	A9187
Acide bis(2-hydroxyéthyl)-2-aminoéthanesulfonique (BES)	Sigma-Aldrich	Réf. B9879
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	Réf. C1016
Acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
glucose	Sigma-Aldrich	Référence G8270
GTP (Na-GTP)	Sigma-Aldrich	Référence 51120
Acide (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)	Sigma-Aldrich	N° H3375
chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	Référence M8266
chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P9333
Hydroxyde de potassium	Sigma-Aldrich	Référence 3564
chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	Réf. S7653
Hydrogénocarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S5761
hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	Réf. S8045
Outils chirurgicaux et consommables
Grande boîte de Pétri, 90 mm	VWR		décapitation, dissection de la capsule VNO
Petite boîte de Pétri, 35 mm	VWR		couvercle pour dissection VNO, plat pour enrobage dans l’agarose
Grand ciseau chirurgical tranchant	Outils scientifiques fins		décapitation, ablation de la mâchoire inférieure
Ciseaux à os solides	Outils scientifiques fins		incisives coupantes
Pince moyenne, pince à épiler Dumont #2	Outils scientifiques fins		enlever la peau et le palais
Micro-ciseaux à ressort, 8,5 cm, incurvés, lames de 7 mm	Outils scientifiques fins		découpe de VNO
Deux paires de pinces fines, pince à épiler Dumont #5	Outils scientifiques fins		dissection du VNO à partir d’une capsule cartilagineuse
Petite spatule en acier inoxydable	Outils scientifiques fins		Manipulation de blocs d’agarose et de coupes de tissus
Scalpel chirurgical			Découpe d’un bloc d’agarose en forme pyramidale
équipement
amplificateur	HEKA Elektronik	EPC-10
Capillaires en verre borosilicaté (1,50 mm OD/0,86 mm ID)	Produits scientifiques
Caméra CCD	Microsystèmes Leica	DFC360FX
Cube de filtre, excitation : BP 450-490, suppression : LP 515	Microsystèmes Leica	I3
Lampe à fluorescence	Microsystèmes Leica	EL6000
Agitateur magnétique à plaque chauffante	Snijders	Référence 34532
Microforge	Narishige	Réf. MF-830
Dispositif micromanipulateur	Luigs et Neumann	SM-5
Extracteur de micropipettes, vertical à deux pas	Narishige	PC-10
microscope	Microsystèmes Leica	CSM DM 6000 SP5
Éliminateur de bruit 50/60 Hz (HumBug)	Quest Scientifique
objectif	Microsystèmes Leica	HCX APO L20x/1,00 W
oscilloscope	Tektronik	TDS 1001B
Osmomètre	Gonotec	Osmomat 030
Système de perfusion 8-en-1	AutoMate Scientific
pH-mètre cinq facile	Mettler Toledo
Pot de stockage de pipette	Instruments de précision mondiaux	E212
Chambre d’enregistrement	Luigs et Neumann	Mini chambre à tranches
Lames de rasoir	Wilkinson Sword GmbH	Épée Wilkinson Classique
Les chambres commerciales alternatives sont par exemple BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) ou la préchambre (BSC-PC ; Warner Instruments)	sur mesure
Stéréomicroscope	Microsystèmes Leica	S4E
Interface de déclenchement	HEKA Elektronik	TIB-14 S
Vibratome	Microsystèmes Leica	VT 1000 S
Bain-marie	Memmert	WNB 45