Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Médicaments pour la microionophorèse
REMARQUE : Les médicaments utilisés pour la microionophorèse doivent avoir une charge électrique lorsqu’ils sont dissous dans l’eau. Consultez la littérature pour voir si le médicament d’intérêt est approprié pour cette procédure. Ici, la procédure pour la gabazine, un antagoniste du récepteur GABAA, est décrite.
- Filtrez l’eau distillée à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm pour la stériliser et vous assurer qu’elle ne contient pas de solutés. À l’aide de cette eau distillée, préparez ~1 000 μl de gabazine de 20 mM.
- Ajustez le pH de la dilution à 4 avec du NaOH filtré de 0,2 μm à l’aide d’une électrode de pH à pointe fine.
- Stocker 100 à 200 μl d’aliquotes à -20 ºC. Décongeler le jour de l’enregistrement. Ce jour-là, avant que l’animal ne soit immobilisé, remplissez les barils (3 à 5 μl) de l’électrode multi-barils avec les médicaments, à l’aide d’une microseringue de 100 μl munie d’une aiguille en plastique flexible.
2. Chirurgie et implantation de la tête
- Réaliser des expériences sur deux souris mâles CBA/J (Mus musculus) de 27 et 30 g.
- Dans les jours précédant l’opération, manipulez les animaux et laissez-les explorer librement dans la chambre d’enregistrement pour les habituer à celle-ci. Effectuez trois séances par jour, d’une durée d’au moins 30 minutes chacune. Cela les calmera et les mettra à l’aise pendant les enregistrements.
- Anesthésier la souris à l’aide d’un mélange de kétamine (50 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) injecté par voie intramusculaire. Cette dose anesthésie profondément l’animal pendant environ 1 heure. Donnez des doses supplémentaires d’un tiers de la dose initiale au besoin.
- Placez l'animal sur une couverture chauffante pour maintenir une température de 38 ± 1 ºC et stabilisez la tête de l'animal dans un cadre stéréotaxique à l'aide de deux barres d'oreille et d'une barre de morsure. Attention à ne pas percer la membrane tympanique avec les barres auriculaires.
- Protégez les yeux en appliquant une goutte de gel ophtalmique.
- Rasez le cuir chevelu à l’aide de ciseaux et appliquez de la povidone iodée pour désinfecter la peau.
- À l’aide d’un scalpel, faites une incision le long de la ligne médiane pour exposer le crâne et rétracter le périoste recouvrant le pariétal et la partie plus rostrale des os occipitaux.
- Collez un tenon de tête léger en duralumin (poids ~0,65 g, longueur 30 mm, Figure 1A) avec une base ronde et plate (5 mm de diamètre) sur le crâne. Collez un fil d’argent au milieu de la tige de tête en laissant ses extrémités libres. Le fil d’argent sera utilisé comme électrode de référence pour l’enregistrement électrophysiologique.
- Appliquez une fine couche d’adhésif photopolymérisable sur le crâne et la base du tenon de tête. Attendez 10 secondes et placez le tenon de tête sur la zone rostrale des os pariétaux, le long de la ligne médiane.
- Durcissez l’adhésif à l’aide d’une source de lumière bleue pendant 20 secondes pour une force d’adhérence efficace.
- Percez trois trous autour et derrière la base du poteau de tête à l’aide d’une perceuse électrique et d’un petit foret.
- Placez deux vis de montre (~2 mm de longueur) dans les trous percés pour servir de points de contact supplémentaires entre le crâne et la tête. Les vis nécessitent 1 tour pour obtenir un ajustement parfait. Testez les vis avec une pince pour vous assurer qu’elles ne sont pas desserrées.
- Insérez la pointe du fil de terre en argent dans le troisième trou, en vous assurant qu’il entre en contact avec la dure-mère. Appliquez une petite goutte de colle cyanoacrylate résistante à l’eau pour lier le fil au crâne.
- Appliquez un composite photopolymérisable pour renforcer le lien entre le poteau de tête et le crâne. Couvrez la base de la tige de tête, la partie basse du fil d’argent, et les vis en faisant attention de ne pas s’étendre derrière lambda pour permettre l’accès pendant l’enregistrement. Durcir à l’aide d’une source de lumière bleue.
- Rétractez le muscle à l’arrière du cou près de son insertion sur le crâne. À l’aide d’un petit trépan (2,35 mm de diamètre), percez une fenêtre ronde juste en dessous de la suture lambda et latéralement à la ligne médiane, pour exposer le colliculus inférieur (CI). Tirez l’os de couverture avec une pince à épiler fine lorsque les bordures sont lâches. En cas de saignement, rincez avec une solution saline stérile froide pour l’arrêter.
- Utilisez du composite pour faire un petit mur (~1 mm de large et ~1 mm de haut) autour de la fenêtre et photopolymériser.
- Couvrez le crâne et les muscles exposés avec une pommade antibiotique. Ensuite, mouillez la surface exposée du circuit intégré avec une solution saline stérile et couvrez-la de vaseline, en remplissant le puits généré après avoir fait le mur autour de la fenêtre d’enregistrement.
- Injecter la buprénorphine par voie sous-cutanée (0,03 mg/kg, diluée 1:10 dans une solution saline stérile) comme analgésique.
- Gardez l’animal sur la couverture chauffante jusqu’à ce qu’il se réveille et retournez-le dans sa cage d’hébergement pour se remettre de l’opération pendant trois jours avant les sessions d’enregistrement. Hébergez les animaux dans la cage du logement des rats pour éviter que les compagnons de la cage ne nettoient la gelée et que le poteau de tête ne touche le couvercle de la grille métallique. Placez un peu d’enrichissement dans la cage lorsque l’animal est logé seul. De plus, changez la sciure de bois tous les jours pour éviter les infections et vérifiez soigneusement que l’animal se rétablit correctement et ne montre aucun signe d’inconfort. Vérifiez également si de la vaseline se trouve au-dessus de la fenêtre d’enregistrement protégeant le cerveau exposé.
3. Enregistrement électrophysiologique et microionophorèse
- Après la récupération, donnez à l’animal le temps de s’acclimater à l’environnement d’enregistrement et retenez sa tête. Acclimatez l’animal en fixant le poteau de tête au support pendant que la souris est assise sur un dispositif de retenue en mousse rembourré sur mesure sculpté à la taille de son corps (figure 1B). Cela limitera les mouvements de la souris et contribuera à son calme.
- Commencez par des séances de 10 minutes et augmentez progressivement la durée jusqu’à 120 minutes. Au cours de la séance, récompensez les animaux avec des liquides sucrés (lait concentré, dilué 30:70 dans de l’eau) à intervalles donnés. Plus tard, lors de la session d’enregistrement, donnez la même récompense au début et à la fin de la séance ou alors qu’aucun neurone n’est isolé.
- Si l’animal est excité avant l’enregistrement, injectez le sédatif léger acépromazine (2 mg/kg, intrapéritonéale). Selon le système neuronal d’intérêt, le sédatif peut affecter vos résultats.
- Laissez l’animal explorer librement la chambre d’enregistrement pendant 5 à 10 min.
- Placez le corps de l'animal dans le dispositif de contention rembourré en mousse fait sur mesure (figure 1B).
- Fixez le poteau de tête à un support fixé au cadre stéréotaxique (Figure 1C). C’est le bon moment pour donner à l’animal une récompense liquide.
- Couvrez le corps de l'animal avec une couverture en coton et attachez-le sans serrer à l'aide d'un hémicylindre en plastique et de ruban adhésif.
- Retirez la vaseline de la fenêtre d’enregistrement et rincez-la avec une solution saline chaude et stérile.
- Enregistrer l’activité neuronale et l’application iontophorétique de gabazine.
- Placez l’électrode multibaril sur son support, contrôlé par un micromoteur et fixé à un micromanipulateur.
- Connectez les fils pour l’enregistrement à l’aide de petites pinces crocodiles. Connectez la borne positive à l’extrémité de l’électrode en tungstène et la borne de terre au fil d’argent qui entre en contact avec la dure-mère.
- Placez un fil d’argent non enduit à l’intérieur de chaque baril de sorte qu’une extrémité entre en contact avec la solution et que l’autre soit accessible. Connectez ces extrémités au dispositif de microionophorèse, en suivant les instructions du fabricant.
- Déplacez l'électrode multibaril jusqu'à ce que la pointe entre en contact avec la surface du cerveau. Appliquez une solution saline stérile chaude pour prévenir la dessiccation du tissu cérébral. À ce stade, appliquez un courant de rétention (-10 nA pour la gabazine ; consultez la littérature pour le médicament en question) pour éviter les fuites du médicament par l’extrémité du canon tout en recherchant une activité unitaire.
- Utilisez des techniques standard pour isoler l’activité extracellulaire d’un seul neurone. Obtenir l’aire de réponse en fréquence (FRA) du neurone, c’est-à-dire la combinaison de fréquences et d’intensités capables d’évoquer une réponse car le neurone est sensible à ces sons.
- Choisissez deux fréquences (f1 et f2) qui évoquent une cadence de tir et un schéma similaires. Présentez chacune de ces fréquences comme un stimulus rare et répétitif sous le paradigme bizarre.
note: En bref, dans le paradigme bizarre, une fréquence (f1) est présentée comme le stimulus répétitif avec une forte probabilité d’occurrence, tandis que la seconde (f2) est le stimulus déviant rarement survenu, intercalé au hasard parmi les stimulus répétitifs. Dans une deuxième séquence bizarre, les probabilités relatives des deux stimuli sont inversées.
- Libérez la gabazine en décalant le courant à des valeurs positives (10 - 20 nA). Obtenez à nouveau la FRA et répétez le paradigme bizarre sous l’application de la gabazine. Maintenir l’éjection jusqu’à ce qu’un effet visible sur la cadence de tir soit observé ; Cela prend généralement 5 à 20 minutes, en fonction du médicament particulier, de sa concentration et de l’ampleur du courant d’éjection. Répétez le protocole d'enregistrement pour obtenir les valeurs sous l'effet du médicament.
- Arrêtez l’injection en ramenant le courant aux valeurs de rétention. Attendez que l’effet du médicament disparaisse en vérifiant si la FRA ou la réponse au paradigme bizarre revient aux valeurs de contrôle.
note: Les sessions d’enregistrement peuvent durer 2 à 3 heures par jour et doivent être terminées plus tôt si l’animal montre des signes d’inconfort ou de difficulté. Donnez une récompense liquide et couvrez la chambre d’enregistrement avec de la vaseline.
