Enregistrement de l’activité électrophysiologique du réseau neuronal dans une co-culture neurone-astrocytes

Résumé

Source : Taga, A., et al. Établissement d’une plateforme électrophysiologique pour la modélisation de la SLA avec des astrocytes et des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines spécifiques à une région. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo démontre l’établissement d’une co-culture neurone-astrocytes pour enregistrer l’activité du réseau neuronal. Lors de l’établissement de la co-culture de motoneurones et d’astrocytes sur une plaque de réseau multi-électrodes (MEA), l’activité électrique rythmique synchrone du réseau neuronal a été enregistrée extracellulaire à l’aide de la MEA.

Protocole

1. Co-culture de MN et d’astrocytes de la moelle épinière dans des plaques multi-électrodes

1. Différencier et plaquer les motoneurones et les astrocytes lorsqu’ils sont prêts à être utilisés le même jour et vieillis au jour le jour in vitro (DIV) 60 pour les motoneurones et DIV 90 pour les astrocytes.
2. Enduire les plaques MEA la veille ou le jour du placage comme suit si vous travaillez avec des plaques en plastique à 24 puits (Table des matériaux).
3. Diluer la polyornithine (PLO) dans de l’eau ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 100 μg/mL.
   1. Ajoutez 15 à 20 μL dans chaque puits (en fonction du niveau de confort de la pipette), en formant une gouttelette au centre du puits couvrant la zone des électrodes et la zone environnante, mais pas la totalité du puits.
   2. Veillez à ne pas endommager les électrodes avec la pointe de la pipette. Soyez cohérent avec le volume d’un puits à l’autre pour assurer la couverture de la même surface dans chaque puits.
   3. Incuber PLO à 37 °C pendant au moins 1 h (de préférence 2 h).
      note: Les petits volumes vont se tarir s’il n’y a pas assez d’humidité dans les plaques. Ajoutez de l’eau dans les compartiments entourant les puits pour assurer une humidité suffisante tout au long du revêtement et des enregistrements.
4. Aspirez autant de PLO que possible à l’aide d’une pointe de micropipette en plastique. Veillez à ne pas toucher les électrodes. Laver trois fois avec 250 μL d’eau. Si vous utilisez un aspirateur pour les lavages, ne laissez pas la pointe s’approcher du réseau d’électrodes. Après le troisième lavage, retirez autant d’eau que possible, à l’aide d’une pointe de pipette si nécessaire. Laissez sécher la surface sous le capot de culture cellulaire avec le couvercle retiré.
5. Une fois que les surfaces des plaques sont sèches, ajouter de la laminine diluée à 10 μg/mL dans du PBS. Utilisez 15 à 20 μL pour couvrir chaque réseau d’électrodes. Ajoutez de l’eau dans les compartiments d’humidité, remettez le couvercle en place et remettez la plaque à 37 °C pendant au moins 2 h jusqu’à toute la nuit.
6. Le jour de l’ensemencement, rincez une fois les cultures de motoneurones (MN) et d’astrocytes avec du PBS et ajoutez de la trypsine à 0,05 % à 37 °C pour soulever les cellules (5 min). Recueillir dans un tube conique de 15 mL contenant un inhibiteur de trypsine et laver les plaques avec le milieu ou la base pour s’assurer que toutes les cellules sont recueillies. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et remettre en suspension avec une pipette de 1000 μL pour générer 1 mL d’une suspension unicellulaire. Lors de la remise en suspension de MN et d’astrocytes, passer au milieu de co-culture (tableau 1), avec l’ajout d’une bobine enroulée de 20 μM associée à Rho formant un inhibiteur de la protéine sérine/thréonine kinase (ROCK-I).
7. Comptez les MN et les astrocytes en parallèle à l’aide d’un hémocytomètre. Pendant que vous comptez et faites des calculs, fermez les suspensions des cellules et placez-les dans une grille en polystyrène à 4 °C.
8. Calculez le volume nécessaire pour remettre les cultures en suspension à une concentration de 5 x 10⁴ cellules par 5 μL pour les motoneurones et de 2,5 x 10⁴ cellules par 5 μL pour les astrocytes. Centrifuger les suspensions cellulaires de 1 mL à 300 x g pendant 5 min et les remettre en suspension dans le volume calculé.
9. Calculez le nombre de puits souhaités à ensemencer et multipliez-le par 5 μL de chaque suspension cellulaire. Combinez le volume requis de suspensions de neurones et d’astrocytes dans un rapport de 1:1 et mélangez par pipetage jusqu’à ce que le tout soit bien combiné (généralement deux fois), mais évitez d’être trop agressif.
10. Retirez la laminine de chaque puits de la plaque MEA à l’aide d’une pointe de pipette. Transférez 10 μL de la suspension cellulaire combinée finale dans chaque puits, formant une petite gouttelette recouvrant le réseau d’électrodes pour fournir une densité cellulaire de 5 x 10⁴ MN et de 2,5 x 10⁴ astrocytes par puits.
    note: La densité cellulaire élevée dans la suspension combinée nécessite une remise en suspension fréquente entre les puits pendant l’étape d’ensemencement pour assurer un comptage précis et constant des cellules.
11. Remettez les plaques dans l’incubateur pendant 20-30 min. Veillez à ne pas déranger les gouttelettes cellulaires et laissez les cellules former des attaches initiales sur les plaques.
12. Après 20 à 30 min, ajoutez un milieu de co-culture chaud + ROCK-I dans chaque puits en pipetant 250 μL sur la paroi de chaque puits, suivi de 250 μL supplémentaires sur la paroi du même puits du côté opposé. Remettez la plaque dans l’incubateur.
13. Examinez les plaques le lendemain de l’ensemencement (jour 1 de co-culture). S’il y a beaucoup de débris cellulaires ou de cellules mortes, remplacez le milieu par un milieu de co-culture frais contenant du ROCK-I. Sinon, changez le milieu le deuxième jour après l’ensemencement (jour de coculture 2) pour le milieu de coculture sans ROCK-I. Effectuez des échanges demi-moyens (aspirer 50 % et ajouter 60 % du volume final pour tenir compte de l’évaporation) deux fois par semaine.
14. Si vous utilisez des systèmes MEA avec des plaques de verre à puits unique de 30 mm (Table des matériaux), la préparation des plaques peut prendre 2 jours ou plus. Suivez les étapes ci-dessous pour ce faire.
15. Soulevez les cellules et les débris cellulaires des cultures MEA précédentes avec 0,05 % de trypsine pendant 5 à 15 min.
16. Aspirez la trypsine et rincez trois fois à l’eau.
17. Stérilisez en ajoutant 70 % d’éthanol et incubez dans la hotte pendant 10 min. Aspirez l’éthanol, puis rincez à l’eau trois fois.
18. Appliquez un détergent anionique à 1 % avec l’enzyme protéase dans l’eau. Couvrez les assiettes avec un couvercle et enveloppez-les d’un film thermoplastique et de papier d’aluminium, puis laissez-les sur une bascule à température ambiante pendant la nuit.
19. Aspirez le détergent, puis rincez trois fois à l’eau.
20. Si vous prévoyez de stocker les plaques, ajoutez un volume suffisant d’eau. Couvrez les assiettes avec un couvercle et enveloppez-les d’un film thermoplastique et de papier d’aluminium et laissez-les au réfrigérateur jusqu’à la prochaine utilisation.
21. Si vous prévoyez d’enduire la surface, laissez sécher la surface sous le capot de culture cellulaire.
22. Si une stérilisation supplémentaire est nécessaire (par exemple, une infection antérieure ou une utilisation non récente), à ce stade seulement, exposez les plaques MEA à la lumière ultraviolette (UV) sous le capot pendant 30 à 60 min
    note: Éviter les rayons UV fréquents évitera d’endommager les électrodes. L’utilisation de la lumière UV lorsque les plaques contiennent du sérum entraînera des électrodes non fonctionnelles, c’est pourquoi elle ne doit être utilisée que sur des plaques nettoyées.
23. Lorsque les plaques sont complètement sèches, procédez au nettoyage au plasma pendant 1 minute pour charger la surface vitrée des plaques MEA et améliorer l’efficacité du revêtement. Nettoyez au plasma au moins une fois tous les 4 à 5 cycles de nettoyage-placage de plaques MEA.
    1. Comme alternative, lorsque le nettoyage au plasma n'est pas réalisable ou n'est pas justifié, ajoutez un volume suffisant de milieu contenant du sérum de veau fœtal (FBS) pour couvrir la surface des plaques MEA et retournez-les dans l'incubateur pendant la nuit.
24. Utilisez un revêtement PLO (polyornithine)/laminine. Ajouter la solution PLO (100 μg dans du PBS) immédiatement après le nettoyage au plasma ou l’aspiration et le rinçage du milieu contenant du FBS.
25. Plaquez les cellules comme ci-dessus aux densités suivantes : 1 x 10⁵ astrocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hiPSC-A) / plaque et 5 x 10⁵ motoneurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hiPSC-MN)/plaque.

2. Enregistrement par réseau multi-électrodes

1. Extrayez les données de tension brutes à une fréquence d’échantillonnage de 12,5 kHz, à l’aide d’un filtre Butterworth avec un filtre passe-haut de 200 Hz et un filtre passe-bas de 3 kHz. Définissez la reconnaissance des pointes sous forme de points temporels instantanés de tensions ≥6 écarts-types par rapport à la ligne de base. Identifiez les rafales en tant qu’activité avec >5 pics en 100 ms. Définissez l’activité du réseau lorsque plus de 35 % du total des électrodes actives se déclenchent dans les 100 ms avec un minimum de 50 pointes par rafale de réseau.
2. Commencer l’enregistrement dès que possible après le jour 1.< de la co-culture (CC) /> note: L’activité électrique sera rarement notée avant le CC Jour 3.
3. Des cultures parallèles sur plaques à des densités similaires et des réplicats dans les plaques de culture ou les lamelles appropriées pour les tests biochimiques, l’immunocytochimie (ICC) ou la PCR quantitative (qPCR).
4. Effectuez des enregistrements avec une température réglée sur 37 °C et un CO₂ à 5 %. Transférez les plaques dans la machine et laissez-les s’équilibrer pendant au moins 5 minutes avant l’enregistrement.
5. Enregistrez l’activité de base tous les deux jours ou toutes les semaines, sur une période de 1 à 15 minutes selon le plan d’expérience. N’enregistrez pas pendant au moins 1 h après un échange de support, et idéalement attendez 24 h après chaque échange de support.
6. Pour éviter la contamination, changez le milieu (c.-à-d. demi-échange de milieu comme à l’étape 1.14) après tout enregistrement au cours duquel le couvercle de la plaque stérile doit être ouvert à l’extérieur du capot stérile (c.-à-d. l’application de composés médicamenteux). Effectuez des remplacements et des lavages complets de fluide pour éliminer les médicaments si les plaques doivent continuer à être utilisées au-delà du traitement médicamenteux.
7. À des fins d’analyse, utilisez au moins trois répétitions techniques et biologiques pour chaque condition. Exprimer les données électrophysiologiques au moyen de n ≥ 3 répétitions.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de culture stériles de 10 cm	Faucon	353003
25 cm 2 flacons de culture stériles	Faucon	353136
500 mL 0,2 μm CA Système de filtration	Corning	430769
Pipette de 5 mL	Faucon	357543
6 plaques de culture bien stériles	Faucon	Référence 3046
Plaques Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)	axion	OPT-24
Plate-forme Axion Edge MEA	axion	Maestro Edge
Matrice de membrane basale - Matrigel	Corning	354277	Détails dans le protocole
Microscope de paillasse (stérile sous capot de culture cellulaire)	Zeiss	Tél. : 415510-1100-000	Primo Vert
Facteur neurotrophique ciliaire (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissoudre 100 μg dans 1 mL de PBS stérile, puis ajouter 9 mL de BSA-PBS stérile à 0,1 % à 10 μg/mL. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer à 1:1000 pour utilisation. (concentration de travail 10 ng/mL).
Réservoirs de CO2 et détendeur pour Axion Edge	AirGas/Harris	Référence 9296NC
DMEM/F12	Thermopêcheur	Référence 113300	Concentration de travail 1x
Supplément Essential 8 Medium + Essential 8	Thermopêcheur	A1517001	Combinez 10 ml de supplément Essential 8 (10x) avec 500 mL de milieu de croissance Essential 8 (1x)
Sérum fœtal bovin (FBS)	Thermopêcheur	16140071	Concentration de travail 1x
Hémocytomètre	Sciences de la microscopie électorale	Référence 63510-20
Incubateur de culture cellulaire à humidité contrôlée	ThermoFisher	370	réglé à 37 ºC, 5 % CO2
Laminine	Thermopêcheur	Référence 23017-015	Solution mère 1 mg/mL, concentration de travail 10 μg/mL (enrobage), 1 μg/mL (milieu cellulaire)
L-Glutamine	Thermopêcheur	Référence 25030	Dissoudre 2 mg de LDN dans 500 μL de chloroforme pour obtenir 10 mM de stock. Aliquotez-le et congelez à -80 ºC. Pour l’utilisation, diluez d’abord la matière 1 à 10 dans du DMSO [à 1 mM], puis diluez 1:5000 de 1 mM dans le milieu souhaité pour obtenir une solution de travail de 0,2 μM
Plaques de verre MEA	Systèmes multicanaux	60MEA200/30iR-Ti-gr	Concentration de travail 100x
Pipette multicanaux P200	Gilson	PJ22224
Neurobasale	Thermopêcheur	21103049
Acides aminés non essentiels (NEAA)	Thermopêcheur	11140050	Concentration de travail 1x
Crayonline/Streptomycine	Thermopêcheur	15140122	Concentration de travail 100x
Polyornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	Réf. P3655	Concentration de travail 100x
Chlorure de potassium (KCl)	Na	Na	Dissoudre 100 mg dans 1 mL de ddW pour obtenir une solution mère de 100 mg/mL. Aliquote de la crosse dans des tubes de 100 μL. (concentration de travail 100 μg/mL)
Purmorphamine (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Concentration de travail100 mM
Inhibiteur de ROCK	Peprotech	1293823	Centrifuger brièvement avant de reconstituer. Dissoudre 100 μg dans 1 mL de PBS à 100 μg/mL, puis ajouter 9 mL de BSA-PBS stérile à 0,1 % à 10 μg/mL. Aliquote et congélation à -80 ºC. Diluer à 1:1000 pour utilisation. (concentration de travail 10 ng/mL).
Hottes de culture cellulaire stériles	Entreprise Baker	SG-600	Dissoudre 5 mg dans 1480 μL de dH2O pour obtenir 10 mM de bouillon, aliquote et congeler à -80 ºC. Diluer à 1:500 pour l’utilisation. (concentration de travail 20 μM).
Supplément B - Supplément B27	Thermopêcheur	21985023
Centrifugeuse de culture cellulaire de table	ThermoFisher	75004261	Concentration de travail 50x
Film thermoplastique - Parafilm	PARAFILM	Réf. P7793	Sorvall Legend X1R
Trypsine-EDTA (0,05 %)	Thermopêcheur	2530054	Concentration de travail 1x
Bain d’eau	ThermoFisher	Référence 2332	Isotemp