Mesure simultanée du calcium intracellulaire et du potentiel membranaire dans l’endothélium cérébral d’une souris

Résumé

Source : Hakim, M. A. et al. Mesures simultanées du calcium intracellulaire et du potentiel membranaire dans un endothélium cérébral de souris fraîchement isolé et intact. J. Vis. Exp. (2019)

La vidéo montre la mesure simultanée des niveaux de calcium intracellulaire et des modifications du potentiel membranaire dans les cellules endothéliales des segments de l’artère cérébrale de souris. Le tube endothélial isolé est chargé d’un indicateur de calcium fluorescent et traité avec un médicament qui induit la libération intracellulaire de calcium, entraînant une modification du potentiel membranaire. La fluorescence de l'indicateur permet de mesurer les niveaux de calcium, et une électrode d'enregistrement est insérée dans une cellule pour mesurer les changements de potentiel membranaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Dissection et isolement de l’artère cérébrale

REMARQUE : Toutes les procédures de dissection nécessitent un grossissement de l’échantillon (jusqu’à 50x) via des stéréomicroscopes et un éclairage fourni par des sources lumineuses à fibre optique. Pour effectuer des procédures de dissection afin d’isoler le cerveau et les artères, utilisez des instruments de dissection aiguisés. Les outils de microdissection pour isoler et nettoyer les artères comprennent des pinces à pointe fine aiguisées et des ciseaux de dissection de style Vannas (lames de 3 à 9,5 mm).

1. Isolement du cerveau de la souris
   1. Anesthésier une souris C57BL/6 (âgée de 3 à 30 mois, mâle ou femelle) par inhalation d’isoflurane (3 % pendant 2 à 3 minutes), puis décapiter l’animal immédiatement après l’induction complète de l’anesthésie. Placez la tête dans une boîte de Pétri (diamètre 10 cm, profondeur 1,5 cm) contenant une solution saline physiologique (PSS) froide (4 °C) de zéro Ca²⁺ sous un stéréomicroscope.
   2. En regardant au microscope, retirez la peau et les cheveux sur le crâne et éliminez l’excès de sang avec un froid zéro Ca²⁺ PSS. Faites une incision à l’aide uniquement des pointes de ciseaux de dissection standard (par exemple, une lame de 24 mm), en commençant par l’os occipital et en remontant à travers l’os nasal du crâne.
   3. Ouvrez le crâne avec précaution le long de l’incision à l’aide d’une pince à pointe grossière et séparez le tissu conjonctif pour isoler le cerveau avec un cercle de Willis intact.
      REMARQUE : Alternativement, la pince à couper l’os Littauer peut être utilisée pour ouvrir le crâne et exposer le cerveau.
   4. Lavez doucement le cerveau isolé avec du froid zéro Ca²⁺ PSS dans un bécher pour éliminer le sang. Placez la face ventrale du cerveau vers le haut dans une chambre contenant une solution de dissection froide pour isoler les artères cérébrales (Figure 1A).
2. Isolement des artères cérébrales
   REMARQUE : L’artère cérébrale postérieure a été sélectionnée comme modèle d’étude endothéliale cérébrovasculaire représentatif pour ce protocole.
   1. Fixez le cerveau isolé dans une solution de dissection froide à l’aide de broches en acier inoxydable (diamètre 0,2 mm, longueur ~11-12 mm) à insérer dans un polymère de silicium infusé de charbon de bois recouvrant le fond (profondeur ≥50 cm) d’une boîte de Pétri en verre.
   2. Pour maintenir une température réfrigérée du PSS pendant la dissection, utilisez une chambre de dissection refroidie par un système de réfrigérant faisant circuler en continu un mélange d’eau et d’éthylène glycol 1:1. Alternativement, la dissection peut être effectuée sur de la glace fraîche.
   3. Isoler chirurgicalement les artères cérébrales postérieures (segments de ~0,3 à 0,5 cm, pas de tension axiale) des artères communicantes et basilaires postérieures à l’aide d’instruments de microdissection, de ciseaux de style Vannas et de pinces à pointe fine aiguisées (Figure 1B). Utilisez des broches en acier inoxydable (diamètre 0,1 mm, longueur ~13-14 mm) pour fixer les deux artères cérébrales postérieures isolées dans la solution de dissection dans la boîte de Pétri (Figure 1C).
   4. Nettoyez soigneusement les artères cérébrales postérieures isolées en enlevant le tissu conjonctif à l’aide d’une pince à pointe fine aiguisée (Figure 1D). Couper les artères intactes en segments (longueur 1 à 2 mm) pour la digestion enzymatique (figure 1D ; encadré).

2. Préparation du tube endothélial et superfusion

1. Préparez l’appareil de trituration à l’aide d’un microscope équipé d’objectifs (10x, 20x et 40x), d’une caméra et d’une platine en aluminium contenant une chambre et des micromanipulateurs. Fixez une microseringue à l’aide d’un contrôleur de pompe adjacent à la platine et à l’échantillon (Figure 2A).
2. Remplissez complètement une pipette de trituration avec de l’huile minérale et fixez-la sur le piston de la micro-seringue. Ensuite, à l’aide de la micro-seringue avec contrôleur de pompe, prélever la solution de dissociation dans la pipette (~130 nl) au-dessus de l’huile minérale tout en veillant à l’absence de bulles d’air dans la pipette.
3. Placer les segments artériels intacts dans 1 mL de solution de dissociation dans un tube de verre de 10 mL (figure 2B) contenant 0,31 mg/mL de papaïne, 0,5 mg/mL de dithioérythritol, 0,75 mg/mL de collagénase et 0,13 mg/mL d’élastase. Incuber à 34 °C pendant 10 à 12 min pour une digestion partielle.
4. Après la digestion, remplacer la solution enzymatique par ~5 mL de solution fraîche de dissociation. À l’aide d’une pipette de 1 mL, transférez un segment dans une chambre contenant la solution de dissociation à température ambiante (RT).
5. Placez la pipette dans la solution de dissociation dans la chambre et positionnez-la près d’une extrémité du récipient digéré. Réglez un débit compris entre 2 et 5 nL/s sur le contrôleur de pompe pour une trituration en douceur (Figure 2C ; encadré).
6. Tout en regardant avec un grossissement de 100x à 200x, retirez et éjectez le segment artériel pour dissocier les cellules musculaires lisses tout en produisant un tube endothélial. Si nécessaire, utilisez soigneusement une pince à pointe fine pour séparer les adventices dissociées et la lame élastique interne du tube endothélial. Confirmer que toutes les cellules musculaires lisses sont dissociées et que seules les cellules endothéliales restent sous la forme d’un « tube » intact (Figure 2C).
7. À l’aide de micromanipulateurs, fixer chaque extrémité du tube endothélial sur la lamelle de verre de la chambre de superfusion à l’aide de pipettes à goupillage en verre borosilicaté (figure 2D).
8. Éliminez les adventices dissociées et les cellules musculaires lisses de la chambre et remplacez la solution de dissociation par 2 mM de CaCl₂ PSS. Transférez la plate-forme mobile avec tube endothélial sécurisé sur le microscope de superfusion et le banc expérimental.
9. Utiliser 6 réservoirs propres de 50 mL (figure 3A) pour l’administration continue de PSS et des solutions médicamenteuses respectives pendant l’expérience, le cas échéant. Utilisez la soupape de régulation de débit en ligne pour régler manuellement le débit tout au long de l’ensemble du débit en fonction du flux laminaire tout en adaptant l’alimentation du débit à l’aspiration sous vide. Administrer le PSS dans la chambre (figure 3B) pour la superfusion du tube endothélial pendant ≥ 5 minutes avant d’enregistrer les données de fond et le chargement du colorant.

3. Charge de colorant, lavage et réglages de température

1. Mettez en marche tous les composants du système de photométrie pour mesurer [Ca²⁺]_i. Utilisez le microscope sur le banc d’essai (figure 3C) pour visualiser le tube endothélial à un grossissement de 400x, et concentrez-vous sur les cellules dans la fenêtre photométrique à l’aide de la suite logicielle du système de photométrie.
2. Mesurez le diamètre du tube endothélial et enregistrez les valeurs d’autofluorescence de fond en accord avec l’émission de 510 nm lors d’une excitation alternée à 340 et 380 nm (≥10 Hz).
3. Pour mesurer les réponses intracellulaires en Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i), chargez le tube endothélial avec le colorant Fura-2 AM (ester de Fura-2-acétoxyméthyle, concentration finale de 10 μM) à RT et laissez ~30–40 min en l’absence de lumière.
4. Redémarrer la superfusion du tube endothélial avec du PSS frais pendant ~30 à 40 minutes pour éliminer l’excès de colorant et permettre à Fura-2 AM intracellulaire de se désestifier. Pendant la période de lavage, augmenter progressivement la température de RT à 37 °C à l’aide du régulateur de température (Figure 3A) avec un chauffage en ligne, puis maintenir à 37 °C pendant toute la durée de l’expérience.
   note: La transition incrémentielle recommandée entre RT et 37 °C comprend trois étapes (par exemple, 5 °C) avec un temps d’équilibrage de ≥5 minutes à chaque étape.

4. Mesure simultanée de [Ca²⁺]_i et V_m

1. Mettez en marche tous les autres équipements et la suite logicielle d’électromètres pour mesurer le potentiel de membrane (V_m, voir Figure 3, Figure 4). Ajustez le taux d’acquisition de données en conséquence (≥10 Hz).
2. Tirez une électrode pointue et remplissez avec 2 M de KCl. Pour les études de couplage intercellulaire par transfert de colorant, remplissez les microélectrodes avec de l’iodure de propidium à 0,1 % dissous dans 2 M KCl.
3. Fixez l’électrode sur un fil d’argent recouvert de chlorure dans le support de pipette fixé à une platine de tête d’électromètre fixée à l’aide d’un micromanipulateur. Utilisez le micromanipulateur pour positionner brièvement la pointe de l’électrode dans le PSS qui s’écoule dans la chambre tout en regardant à travers l’objectif 4x.
4. Réglez le V_m au repos à 0 en fonction du potentiel du bain mis à la terre. Placez l’extrémité de l’électrode juste au-dessus d’une cellule du tube endothélial. Si vous le souhaitez, utilisez des moniteurs de ligne de base audibles reliés à des électromètres pour associer la hauteur du son à des enregistrements potentiels.
5. Augmentez le grossissement à 400x à l’aide de l’objectif 40x et repositionnez la pointe de l’électrode au besoin. Ajustez la fenêtre photométrique à l’aide du logiciel de photométrie pour vous concentrer sur ~50 à 80 cellules endothéliales.
6. Placez doucement l’électrode dans l’une des cellules du tube endothélial à l’aide du micromanipulateur et attendez ≥2 min que le V_m au repos se stabilise. De même, insérez une deuxième électrode dans une autre cellule (distance ≥100 μm) de la première cellule empalée avec la première électrode.
7. Une fois que V_m au repos est stable à ses valeurs attendues (-30 à -40 mV), allumez le PMT sur l’interface de fluorescence en l’absence de lumière et commencez l’acquisition de [Ca²⁺]_i intracellulaire en excitant Fura-2 alternativement (10 Hz) à 340 et 380 nm tout en captant l’émission de fluorescence à 510 nm.
   REMARQUE : Pour tester le couplage électrique intercellulaire, le courant (± 0,5-3 nA, durée d’impulsion de ~20 s) peut être délivré par un électromètre en tant que « Site 1 », et les changements de V_m peuvent être enregistrés avec un autre électromètre en tant que « Site 2 » (distance ≥100 μm).
8. Une fois que les mesures simultanées de V_m et de [Ca²⁺]_i sont établies, prévoir ~5 min pour la superfusion du tube endothélial avec le PSS à un débit laminaire constant avant l’application des médicaments.
9. Appliquez le médicament (p. ex., l’adénosine triphosphate [ATP]) préparé dans le PSS dans la chambre de superfusion avec un débit constant. Après ~3 min (ou une période de temps appropriée à la cinétique du médicament), laver avec du PSS jusqu’à ce que V_m et le rapport F₃₄₀/F₃₈₀ reviennent à leurs conditions de base. Marquez les enregistrements respectifs comme synchronisés temporellement dans les suites logicielles de photomètres et d’électromètres lors de chaque transition de solutions.
10. Une fois l’expérience terminée, retirez l’électrode de la cellule à l’aide du micromanipulateur et remarquez V_m ~ 0 mV comme référencé par l’électrode du bain. Arrêtez les enregistrements respectifs de V_m et [Ca²⁺]_i et sauvegardez les enregistrements archivés pour l’analyse des données.

Résultats

Figure 1 : Isolement de l’artère cérébrale du cerveau. (A) Cerveau isolé avec des artères intactes (la flèche blanche indique l’artère cérébrale postérieure) dans une solution de dissection. (B) Vue agrandie de l’artère cérébrale postérieure (flèche blanche ; ~3x vs.Partie A). (C) Artères cérébrales postérieures isolées fixées par des...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis)	Réf. G7021
NaCl	sigma	Réf. S7653
MgCl2	sigma	M2670
CaCl2	sigma	223506
HEPES	sigma	N° H4034
Kcl	sigma	P9541
NaOH	sigma	Réf. S8045
ATP	sigma	A2383
Hcl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis)	A466250
Collagénase (mélange de type H)	sigma	Réf. C8051
Dithioérythritol	sigma	D8255
Papaïne	sigma	Réf. P4762
Élastase	sigma	E7885
Bsa	sigma	A7906
Iodure de propidium	sigma	Réf. P4170
Dmso	sigma	D8418
Colorant Fura-2 AM	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	Réf. F14185
Refroidisseur à recirculation (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Chambre de superfusion en plexiglas	Warner Instruments, Camden, CT, États-Unis	RC-27
Fond en verre (2,4 × 5,0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Plate-forme en aluminium anodisé (diamètre : 7,8 cm)	Warner Instruments	PM6 ou PH6
Scène compacte en aluminium	Siskiyou, Grants Pass, OR, États-Unis	8090P
Micromanipulateur	Siskiyou	MX10
Stéréomicroscopes	Zeiss, NY, États-Unis	Stemi 2000 et 2000-C
Sources lumineuses à fibre optique	Schott, Mayence, Allemagne & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Microscope inversé Nikon	Nikon Instruments Inc., Melville, NY, États-Unis	Ts2
Objectifs à contraste de phase	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL ; 10X et 20X)
Objectifs fluorescents	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) et 40X (Plan Fluor)
Microscope inversé Nikon	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Contrôleur de pompe à microseringue (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, Floride, États-Unis	SYS-MICRO4
Table d’isolation des vibrations	Fabrication technique, Peabody, MA, États-Unis	Micro-g
Amplificateurs	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, États-Unis	Axoclamp 2B et Axoclamp 900A
Têtes d’affiche	Dispositifs moléculaires	HS-2A et HS-9A
Générateur de fonctions	EZ Digital, Séoul, Corée du Sud	Le FG-8002
Système d’acquisition de données	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, États-Unis	Digidata 1550A
Moniteurs de ligne de base audibles	Ampol US LLC, Sarasota, Floride, États-Unis	BM-A-TM
Oscilloscope à stockage numérique	Tektronix, Beaverton, Oregon, États-Unis	Fiche de données 2024B
Interface système de fluorescence, lampe ARC + alimentation, hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, États-Unis	Systèmes IonOptix
Régulateur de température	Warner Instruments	TC-344B ou C
Réchauffeur en ligne	Warner Instruments	SH-27B
Contrôleur de soupape	Warner Instruments	VC-6
Vanne de régulation de débit en ligne	Warner Instruments	FR-50
Extracteur électronique	Sutter Instruments, Novato, Californie, États-Unis	P-97 ou P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, États-Unis	Réf. MF-900
Tubes en verre borosilicaté (trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, Floride, États-Unis	Référence 1B100-4
Tubes en verre borosilicaté (épinglage)	Warner Instruments	G150T-6
Tubes en verre borosilicaté (électrodes pointues)	Warner Instruments	GC100F-10
Filtre à seringue (0,22 μm)	ThermoFisher Scientific	Référence 722-2520
Boîte de Pétri en verre + fusain Sylgard	Instrumentation des systèmes vivants, St. Albans City, VT, États-Unis	DD-90-S-BLK
Ciseaux de style Vannas (3 mm et 9,5 mm)	Instruments de précision mondiaux	555640S, 14364
Ciseaux 3 et 7 mm lames	Fine Science Tools (ou FST), Foster City, CA, États-Unis	Moria MC52 et 15000-00
Pince à pointe fine aiguisée	Le	Dumont #5 et Dumont #55