Évaluation de la formation de connexions neuronales dans une co-culture à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques

Résumé

Source : Su, C. T. E., et al. Une approche optogénétique pour évaluer la formation de connexions neuronales dans un système de co-culture. J. Vis. Exp. (2015)

La vidéo montre un enregistrement électrophysiologique permettant d’évaluer les connexions neuronales entre les neurones corticaux dérivés d’iPSC et les neurones corticaux de rat, confirmant les contacts synaptiques dans la co-culture en activant les canaux ioniques sensibles à la lumière et en détectant les courants postsynaptiques.

Protocole

1. Enregistrements électrophysiologiques de neurones dérivés d’iPSC

1. Confirmez si les iPSC humaines se comportent comme des neurones matures.
   1. Trouvez des cellules différenciées des iPSC humaines en visualisant tdTomato à l’aide d’un microscope confocal droit équipé d’une lentille d’immersion dans l’eau 60X (0,9 NA).
   2. Tirez la pipette d’enregistrement jusqu’à une résistance de 4 à 6 M. Perfusionnez les cellules à température ambiante dans une solution externe bouillonnée constamment avec 95 % O₂/ 5 % CO₂. Remplissez la micropipette d’enregistrement avec la solution interne.
   3. Patchez la cellule tdTomato+ en mode cellule entière et enregistrez le déclenchement du potentiel d’action en réponse à l’injection de courant (durée de 1 seconde, incréments de 10 pA) dans la pince de courant.
2. Confirmer si le potentiel d’action des cellules corticales exprimant ChR2 est évoqué de manière fiable par la stimulation lumineuse.
   1. Trouver des cellules corticales exprimant ChR2 par visualisation de la GFP au microscope confocal. Effectuez l’enregistrement par patch clamp de cellules entières sur des cellules corticales en suivant les étapes 1.1.2 à 1.1.3.
   2. Vérifiez que le potentiel d’action est évoqué de manière fiable par un éclairage lumineux avec une lampe à arc au mercure (100 W). La longueur d’onde du filtre d’excitation est de 480/40 nm.
3. Effectuer une stimulation optogénétique.
   1. Patchez la cellule tdTomato+ en mode cellule entière et réglez la pince de tension à -70mV. Filtrez les signaux de courant à 2 kHz et numérisez à 10 kHz. Résistances de la série Monitor allant de 10 à 20 M pour une cohérence lors des enregistrements.
   2. Stimulez l’ensemble du champ avec une lampe au mercure de 100 W avec un filtre d’excitation 480/40 nm pendant 30 sec.
   3. Enregistrer les courants postsynaptiques (PSC) des cellules patchées induits par la photostimulation des neurones corticaux présynaptiques exprimant ChR2. Détecter et mesurer les PSC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaCl	sigma	Réf. S7653
Kcl	sigma	Réf. P5405
NaHCO3	sigma	S5761
NaH2PO4	Fluka	Référence 71505
MgCl2	sigma	Référence M8266
CaCl2	sigma	Réf. C1016
D(+)-Glucose	sigma	Réf. G7520	Pour les études électrophysiologiques
K-gluconate	sigma	P1847
Koh	KANTO Chemical	Référence 3234400
HEPES	sigma	N° H3375	Pour les études électrophysiologiques
EGTA	sigma	E3889
Na2ATP	sigma	A7699
Na3GTP	sigma	Référence G8877
Capillaires en verre borosilicaté	World precision instruments, Inc	1604323
Lampe à arc court au mercure	OSRAM	HBO 103 W/2