Imagerie de la signalisation calcique induite par la nicotine le long des axones ventraux de l’hippocampe dans des co-cultures synaptiques

Résumé

Source : Zhong, C., et al., Imagerie en direct de la signalisation calcique induite par la nicotine et de la libération de neurotransmetteurs le long des axones de l’hippocampe ventral. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre comment l’activation des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine dans l’hippocampe ventral de la souris par la nicotine entraîne une signalisation calcique soutenue le long des axones.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Imagerie calcique

1. Rincer rapidement les cultures (5 à 7 jours in vitro) avec un HBS normal, puis charger les cultures avec un indicateur 5 μM Fluo-4 Ca²⁺ (ester AM) et 0,02 % de Pluronic F-127 dans HBS (2 ml) pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Rincer la solution Fluo-4 avec HBS (3 fois/5 min). Remettre les cultures dans l’incubateur (37 °C / 5 % CO₂) pendant au moins 30 min.
3. Conservez les cultures (5 à 7 jours in vitro) dans une chambre d’imagerie et montez la chambre sur un microscope confocal à disque rotatif. Perfuser en continu (1 ml/min) avec le cocktail HBS à RT.
4. Collecter des images de fluorescence Fluo-4 des projections axonales des micro-coupes vHipp avec un objectif Plan-Apochromat (eau 60X avec 1,4 NA, excitation 488 nm, émission 530 nm) et une caméra CCD.
5. Recueillir des images de fluorescence de base Fluo-4 (toutes les 10 secondes pendant 2 minutes) comme contrôle pré-nicotinique. Appliquer la nicotine (1 μM) par perfusion rapide (2 ml/min) pendant 1 min, puis laver la nicotine avec un cocktail HBS. Continuez à capturer des images en accéléré avant, pendant et après l’application de nicotine toutes les 10 secondes pendant 30 minutes.
6. Enregistrez toutes les images des images brutes de fluorescence fluo-4 et exportez-les sous la forme d’une série d’images TIFF pour une analyse plus approfondie.
7. Recueillir l’intensité intégrée de la fluorescence fluo-4 le long des axones vHipp avant et après l’application de nicotine.
8. Normalisez l’intensité de fluorescence intégrée à l’aide de l’équation suivante : ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, où F₀ est l’intensité de fluorescence intégrée pré-nicotinique corrigée du bruit de fond, et F est l’intensité de fluorescence intégrée le long des axones vHipp à chaque point temporel après l’application de nicotine. Analysez et tracez l’intensité de fluorescence intégrée normalisée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cocktail HBS pour l’imagerie en direct pH=7,3
NaCl	sigma	Réf. S9888	135 millions d’euros
Kcl	sigma	P9333	5 millions d’euros
chlorure de magnésium	sigma	Référence M8266	1 million d’euros
Chlorure de calcium	sigma	Réf. C1016	2 millions d’euros
HEPES	sigma	N° H3375	10 millions d’euros
glucose	sigma	G0350500	10 millions d’euros
Tétrodotoxine	Tocris	N° 1078	2 μM
Bicuculline	Tocris	131	10 μM
D-AP-5	Tocris	105	50 μM
CNQX	Tocris	N° 1045	20 μM
LY341495	Tocris	1209	10 μM