Test de la fonction nerveuse sensorielle dans un modèle de souris dénervée chirurgicalement

Abstract

Source : Peterson, S. C. et al., Dénervation chirurgicale cutanée : une méthode pour tester l’exigence de nerfs dans des modèles murins de maladies de la peau. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre comment tester la fonction nerveuse sensorielle dans un modèle murin en dénervant chirurgicalement un côté et en laissant l’autre comme témoin. La réponse à la stimulation mécanique confirme le rôle des nerfs sensoriels.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Dénervation chirurgicale

1. Injecter la solution anesthésique par voie intrapéritonéale à une dose de 200 μl par 20 g de poids corporel de souris. Vérifiez que l’animal a atteint le bon niveau de sédation par pincement des orteils et confirmez que les fréquences cardiaque et respiratoire sont normales (environ 600 battements et 160 respirations par minute, respectivement).
2. Préparez la zone chirurgicale de la peau du dos à l’aide de bétadine et de lingettes imbibées d’alcool, et couvrez l’animal avec un champ chirurgical stérile (à des fins de démonstration, le champ stérile a été omis pour augmenter la visibilité). Gardez l’animal au chaud à l’aide d’un coussin chauffant pendant l’opération dans une zone chirurgicale aseptique.
3. Faites une incision à l’aide d’un scalpel stérile #11 le long de la ligne médiane dorsale de la base du cou jusqu’à environ 0,5 cm au-dessus de la queue.
4. À l’aide d’une pince émoussée, réfléchissez doucement la peau du côté gauche loin du flanc pour visualiser le tissu sous-jacent des coussinets adipeux scapulaires près du cou jusqu’à juste au-dessus du membre postérieur.
   note: Les nerfs cutanés dorsaux se présentent sous la forme de brins blancs qui se déplacent caudalement à travers le fascia translucide de la paroi du tronc avant de faire des courbures brusques et de pénétrer dans le tissu conjonctif lâche sous la peau (Figure 1).
5. À l’aide d’une pince ultrafine sous un microscope optique à dissection, on retire les nerfs exclusivement du côté gauche de l’animal situé aux sites anatomiques T3-12 en les épilant à l’endroit où les segments se plient au niveau de la paroi du tronc jusqu’à leurs points d’entrée dans la peau (figure 1).
   1. Orientez la pince verticalement et retirez les nerfs en les saisissant à environ 0,5 cm sous leurs sites de courbure et en tirant vers le haut, ce qui provoque l’étirement et la séparation du nerf des tissus environnants (Figure 1C-E). Veillez à ne pas rompre les vaisseaux sanguins adjacents.
   2. Continuez jusqu’à ce que tous les nerfs s’étendant de la paroi du tronc à la peau soient retirés. Ne perturbez pas les nerfs à l’intérieur du fascia dense de la paroi du tronc. Gardez le tissu humide tout au long de la procédure en appliquant périodiquement des gouttes de solution saline stérile à 0,9 %.
   3. Alternativement, retirez les nerfs en saisissant leurs extrémités proximales près de la paroi du tronc avec des pinces et en coupant avec des ciseaux fins. Ensuite, sectionnez les extrémités distales près de la peau (Figures 1F-H). Enfin, retirez les segments nerveux intermédiaires (Figure 1I).
6. Retirez tous les nerfs du lambeau cutané exposé à l’étape 1.4. Ces fibres comprennent les branches distales des nerfs cutanés dorsaux et apparaissent comme des brins de ramification blancs situés sporadiquement dans le tissu conjonctif du côté dermique du lambeau de peau (Figures 1J-K).
   1. Pour retirer ces fines branches, positionnez les pinces fines à peu près parallèlement à la surface dermique, saisissez les nerfs et pincez vers le haut pour éviter de perturber les vaisseaux sanguins et de perforer la peau. Continuez jusqu’à ce que tous les nerfs visibles aient été enlevés.
7. À l’aide d’une dissection émoussée, réfléchissez la peau sur le côté droit de l’incision médiane dorsale, mais n’enlevez pas les nerfs. Il s’agira d’un contrôle simulé controlatéral.
8. Suturez le long de la ligne médiane dorsale selon un motif interrompu simple pour fermer l’incision à l’aide de sutures en nylon 6-0, selon un motif simple interrompu espacé d’environ 3 mm.
9. Ne remettez pas les souris qui ont subi une intervention chirurgicale dans la même cage que d’autres animaux avant leur rétablissement complet.
10. Surveiller les animaux immédiatement après l’opération jusqu’à ce qu’ils reprennent conscience, et aussi quotidiennement jusqu’à ce que la zone chirurgicale soit guérie, généralement dans un délai d’une semaine. Utilisez des analgésiques conformément aux directives d’utilisation désignées des soins aux animaux de l’établissement si les souris présentent des signes de douleur ou de détresse. Retirez les sutures dans les 7 à 10 jours suivant la chirurgie. note: Si nécessaire, préparer une solution analgésique en diluant du carprofène (solution mère à 50 mg/ml) 1:100 dans de l’eau stérile. Injecter la solution par voie sous-cutanée entre les omoplates près de la peau du cou, à une dose de 200 μl pour 20 g de poids corporel (5 mg/kg de poids corporel de souris).
11. Pour évaluer fonctionnellement la dénervation stable jusqu’à plusieurs semaines après la chirurgie, retirez les poils de la peau dorsale à l’aide d’une tondeuse électrique.
12. Piquez doucement la zone de peau dénervée à l’aide d’une aiguille hypodermique et notez si l’animal réagit, généralement en frissonnant ou en tournant la tête. Si la zone de la peau a été dénervée de manière stable, l’animal ne présentera que peu ou pas de réponse.

Results

Graphique 1. Deux approches pour dénerver la peau dorsale. (A) Schéma de dessin animé de la peau de souris innervée. Les pointillés rouges indiquent une seule excision effectuée le long de la ligne médiane dorsale pour exposer la musculature sous-jacente de la paroi du tronc (violet) ainsi que le derme (gris, astérisque) sous la peau réfléchie. Les nerfs cutanés dorsaux qui se déplacent ver...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampons de préparation à l’alcool	Pdi	Réf. B339
AnaSed (xylazine)	Lloyd	NADA 139-236
Tampons de préparation à la bétadine	Medline	MDS093917
Carprofène (Rimadyl)	Zoetis
Tondeuse rechargeable sans fil	Wahl	Tondeuse modèle 8900
6-0 Sutures en nylon	DemeTECH	NL166012F4P
Pinces ultra fines	Dumont	Référence 0103-5-PO