Étude du postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) dans les photorécepteurs de la drosophile

Résumé

Source : Gutorov, R., et al. Méthodes électrophysiologiques pour mesurer les niveaux de photopigments dans les photorécepteurs de la drosophile. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo présente un protocole expérimental pour étudier le postpotentiel de dépolarisation prolongée (PCA) chez la drosophile aux yeux blancs. L'œil de la mouche est exposé à d'intenses impulsions de lumière bleue pour convertir le photopigment rhodopsine en métarhodopsine, initiant une cascade de signalisation qui ouvre des canaux ioniques positifs et provoque une dépolarisation membranaire. Parce que la lumière bleue empêche la reconversion de la métarhodopsine en rhodopsine, l’afflux continu d’ions positifs entraîne une dépolarisation soutenue, connue sous le nom de postpotentiel de dépolarisation prolongée (PDA).

Protocole

1. Mesure de la postpotentielle dépolarisante prolongée (PCA) à l’aide de l’électrorétinogramme

1. Conditions d’élevage appropriées pour la préparation de Drosophila melanogaster
   1. Élever les mouches D. melanogaster dans des bouteilles contenant du maïs jaune standard contenant des aliments dans un incubateur maintenu à une température de 24 °C et selon un cycle sombre/lumière de 12 h.
   2. Gardez les bouteilles anti-mouches dans l’obscurité au moins 24 heures avant l’expérience.
2. Configuration générale
   1. Préparez les pipettes d’enregistrement en tirant des capillaires en verre borosilicaté remplis de fibres de 1 mm x 0,58 mm (OD x ID) (Figure 1L, O). La résistance des pipettes doit être de 5 à 10 MΩ ; N’importe quel extracteur approprié peut être utilisé.
   2. Enduire deux fils d’argent d’AgCl₂, en insérant un fil d’argent de 0,25 mm dans une solution KCl de 3 M connectée à une alimentation 5 V sur mesure.
   3. Insérez chaque fil d’argent revêtu dans les porte-électrodes (Figure 1N).
   4. Remplissez le capillaire en verre avec la solution de Ringer filtrée (voir le tableau 1) à l'aide d'une seringue à embout allongé (figure 1M).
   5. Insérez le fil-électrode dans le capillaire en verre. Assurez-vous que la solution à l’intérieur du capillaire est en contact avec le fil d’argent.
   6. Insérez les porte-électrodes (Figure 2P, N) dans les deux micromanipulateurs d’électrodes (Figure 2G).
3. Procédure de préparation de la mouche pour les enregistrements électriques
   REMARQUE : Pour garder la mouche dans des conditions adaptées à l’obscurité, utilisez uniquement un éclairage rouge tamisé pendant les étapes suivantes.
   1. Anesthésiez les mouches dans la bouteille avec du gaz_CO2 à l’aide du système de dormeur de mouches (figures 1A, B) et versez-les dans le récipient de couchage.
   2. Choisissez une mouche et tenez-la soigneusement par son aile à l’aide d’une pince à épiler pointue. Couvrez le reste des mouches avec une boîte de Pétri.
   3. Placez la mouche sur le porte-mouche dans la bonne orientation, allongée sur le côté, le dos vers la main (Figure 1P).
   4. Allumez l’alimentation électrique du fer à souder. Réglez le courant sur ~2,25 A. Ce courant devrait chauffer le filament de platine-iridium de 0,25 mm à ~55-56 °C.
   5. Placez une goutte de cire à basse température de fusion (~55-56 °C) sur le fer à souder (Figure 1F).
   6. À l’aide d’une pince à épiler, soulevez la mouche de ses ailes et fixez-la au porte-mouche (Figure 1I) à l’aide du fer à souder.
   7. À l'aide du fer à souder, fixez le dos de la mouche à la surface du support avec de la cire (Figure 1P).
   8. Abaissez la pointe du fer à souder sur le point d’assemblage des pieds et faites fondre la cire pour couvrir tous les pieds ensemble (Figure 1P).
   9. Placez une petite goutte de cire entre la tête et le dos dans la région du cou (Figure 1P).
      REMARQUE : Faites particulièrement attention à ne pas surchauffer la tête de mouche. S’assurer que la mouche est correctement fixée et qu’elle est incapable de bouger pendant l’expérience ; Des mouvements mineurs peuvent créer des artefacts dans les enregistrements. Assurez-vous que les ouvertures de la trachée (entrées respiratoires) dans le thorax et l’abdomen ne sont pas recouvertes de cire.
   10. Placez le porte-mouche (Figure 2Q) dans une cage de Faraday sombre sur un bloc magnétique (Figure 2I) et assurez-vous que la mouche se trouve à ~5 mm de l’extrémité du guide de lumière (Figure 2L).
   11. Placez l'électrode d'enregistrement (figure 2P) au-dessus de l'œil de la mouche et l'électrode de masse (figure 2N) sur le haut du dos de la mouche à l'aide des micromanipulateurs.
   12. Insérez l’électrode de terre à l’arrière de la mouche à l’aide des micromanipulateurs.
   13. Insérez l'électrode d'enregistrement dans la périphérie externe de l'œil de la mouche, de préférence à l'aide de micromanipulateurs.
       note: Après avoir inséré l’électrode dans l’œil, une petite fossette sera observée ; Tirez l’électrode vers le haut sans la retirer de l’œil jusqu’à ce que la fossette disparaisse. Les électrodes peuvent également être immergées dans de petites gouttelettes de gelée d’électrodes appliquées sur le torse et l’œil.
4. Protocole PDA (ce protocole ne peut être effectué que sur des mouches aux yeux blancs)
   1. Donnez une impulsion lumineuse de 5 s d’intensité maximale à l’aide d’un filtre orange (filtre de bord 590, pour convertir le photopigment maximal à l’état R).
   2. Remplacez le filtre orange par un filtre bleu à large bande (BP450/40 nm) et donnez trois impulsions lumineuses de 5 s à l’intensité maximale.
      REMARQUE : Il est également possible de donner une longue impulsion de lumière bleue continue d’intensité maximale jusqu’à ce qu’une réponse de tension à l’état stationnaire soit atteinte.
   3. Attendez 60 s dans l’obscurité, remplacez le filtre bleu par le filtre orange précédent et donnez deux impulsions lumineuses de 5 s avec des intervalles de 60 s.

Tableau 1 : Composition de la solution de Ringer

La solution de Ringer
Réactif	Concentration (mM)
NaCl	130
Kcl	deux
MgCl2	5
CaCl2	deux
HEPES	10
Titrage du pH à 7,15 à l’aide de NaOH et de HCl

Résultats

Figure 1 : Outils et dispositifs nécessaires à la fixation des mouches et à l’enregistrement de la préparation des pipettes. (A) Système de traverses à mouches ; (B) Pédale du système de traverse-mouche ; (C) Source de lumière froide ; (D) Microscope stéréoscopique ; (E) Chauffage de filament de cire ; F) Fer à souder ; (G) Pédale chauffante à filament de cire ; (H) Pince à épiler rugueuse ; (...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 1 mL avec embout allongé			Graphique 1M
1 pince à épiler rugueuse		Dumont #5, Standard	0,1 mm x 0,06 mm, longueur 110 mm, Inox (Figure 1H)
2 lentilles de condensateur
Convertisseur A/N	Dispositif moléculaire	Digidata 1200	Remplacement possible : toutes les données numériques provenant de dispositifs moléculaires (par exemple 1440A) - Figure 2C
amplificateur	Une électronique presque parfaite		Remplacement possible : Instruments Warner - IE251A ou IE-210 (livré avec headstage) - Figure 2D
Table anti-vibration	Newport	VW-3036-OPT-01	Graphique 7H
Capillaires	Appareil de Harvard	Capillaires en verre borosilicaté	1 mm x 0,58 mm (Figure 1O)
Clampex	Dispositif moléculaire		logiciel
Réservoir de CO2
Source de lumière froide	Schott	KL1500 Écran LCD	Graphique 1C
Essuie-glaces délicats	Kimtech		Lingettes Kimwipes (Figure 1K)
Porte-électrode			Convient pour un diamètre extérieur capillaire de 1 mm (Figure 1N, Figure 2N et Figure 2P)
Cage de Faraday	Fait maison		Blindage contre le bruit électromagnétique et rideau avant noir (Figure 2K)
Filtre (couleur)	Schott	OG590, Filtre de bord	Figure 2S
Filtre (couleur)	Schott	BP450/40 nm	Figure 2S
Filtre (couleur)	Blazers	550 milles marins	Figure 2S
Filtre (couleur) pour source de lumière froide	Schott	RG630	Graphique 1C
Filtre (chaleur)	Schott	KG3	Graphique 1S
Filtres (filtre à densité neutre)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 2S
Système de lampe flash	Honeywell		Graphique 2U
Système de traverses avec injecteur	Inject + matic		Graphique 1A-B
Alimentation de la lampe	Pti	LPS-220	Graphique 2W
Détecteur de lumière	Fait maison		Phototransistor (Figure 2O)
Guide de lumière			3 mm de diamètre, 1,3 m de long (Figure 2L,M)
source lumineuse			Lampe au xénon haute pression sans ozone de 75 W (fonctionnant sur 50 W), remplacement possible : Cairn research - OptoLED (Figure 7R)
Cire fondante à basse température	Fait maison		Composé d’un mélange de cire d’abeille (Tm≈62 °C) et de paraffine à ~3:1 pour atteindre une température de fusion de ~55– 56 °C (Figure 6J)
Support magnétique pour mouches	Fait maison		Figure 1I et Figure 2Q
Système de préamplificateur à microélectrodes avec étage de tête	Une électronique presque parfaite		Testeur d’impédance (Figure 2G)
Micromanipulateur (mécanique grossier)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulateur (mécanique fine)	Microsystèmes Leitz	Micromanipulateur mécanique Leitz	Graphique 2F
pCLAMP	Dispositif moléculaire		logiciel
Pétri			60 millimètre
Générateur d’impulsions	AMPI	Maître 8	Graphique 2A
Crème Redux pour l’électrocardiographie	Laboratoires Parker	Redux Electrolyte Crème
Pilote d’obturateur	Uniblitz, Vincent Associés	VCM-D1 monocanal unistable	Graphique 2V
Système d’obturation	Uniblitz, Vincent Associés	LS2 2 mm Volets uni-stables	Graphique 2V
Fil d’argent	Warner Instruments		Diamètre de 0,25 à 1 mm, doit être chloruré
Fer à souder composé d’un filament de platine-iridium			Diamètre de 0,25 mm (Figure 2F)
Microscope à zoom stéréoscopique	Nikon	SMZ-2B	Graphique 1D
Microscope à zoom stéréoscopique	sauvage	Sauvage M5	Avec 6, 12, 25 et 50 réglages de grossissement (Figure 2E)
Filtres à seringue	Millex		Filtre PVDF 22 μm
Extracteur de pipette vertical	Sutter/ Narishige	Modèle P-97/PP-830	Utilisez un extracteur vertical ou horizontal, selon vos préférences (figure 1L)
Chauffage de filament de cire	Fait maison		Graphique 1E-G
Système de lampe flash au xénon	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Graphique 2X