Visualisation et cartographie des voies neuronales dans une tranche de cerveau d’amygdale

Résumé

Source : Bosch, D., et al. Ex vivo Dissection optogénétique des circuits de peur dans les tranches de cerveau. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo présente une procédure d’analyse de la connectivité synaptique entre le cortex préfrontal médian (mPFC) et les neurones de l’amygdale à l’aide de tranches de cerveau aiguës de l’amygdale de souris. Les neurones mPFC de ces souris expriment la channelrhodopsine fusionnée à une protéine fluorescente. Les channelrhodopsines facilitent l’afflux d’ions et la génération de potentiel d’action dans les neurones mPFC lors de l’activation de la lumière. Par conséquent, les neurones mPFC libèrent des neurotransmetteurs qui se lient aux neurones amygdaliens postsynaptiques, déclenchant des courants postsynaptiques qui sont enregistrés pour visualiser la connectivité mPFC-amygdale.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Visualisation et stimulation des fibres présynaptiques

1. Préparez un microscope patch pour l’activation optogénétique des fibres et des cellules :
   1. Centrez la diode électroluminescente (LED) montée sur la voie de diffusion de la lumière.
   2. Mesurez l’intensité lumineuse de la LED au niveau du plan focal arrière et à la sortie de chaque objectif à l’aide d’un wattmètre, en choisissant la longueur d’onde appropriée de 470 nm.
   3. Calculez l’intensité lumineuse en mW/mm² et créez une courbe d’étalonnage (intensité de la LED ( %) en fonction de la puissance lumineuse (mW/mm²)) pour chaque objectif pour les valeurs mesurées pour une longueur d’onde de 470 nm.
2. Récupérez une tranche aiguë de l’amygdale dans la chambre d’interface et placez-la dans la chambre de coupe montée sur le microscope vertical équipé d’une lampe fluorescente. Prenez soin de positionner la tranche de manière à ce que la surface de la tranche tournée vers le haut dans la chambre d’interface soit également tournée vers le haut dans la chambre d’enregistrement. Perfuser la tranche avec du liquide céphalo-rachidien artificiel frais et oxygéné (ACSF) à raison de 1 à 2 ml/min à une température de ~31 °C.
3. Observez les fibres présynaptiques dans la tranche à l’aide de la lampe fluorescente en combinaison avec des ensembles de filtres appropriés pour la protéine fluorescente spécifique exprimée. Utilisez l’objectif 5x pour obtenir une vue d’ensemble (Figure 1E) et l’objectif 60x pour l’évaluation de la densité de la fibre dans la zone cible.
   Remarque : Pour GFP et YFP, utilisez le jeu de filtres « vert » (Excitation 472/20, Beamsplitter 495, Emission 490 LP) pour mCherry utilisez le jeu de filtres « rouge » (Excitation 560/40, Beamsplitter 585, Emission 630/70) comme spécifié dans le tableau des matériaux/équipements.
4. Ouvrez ou limitez l’ouverture de la voie lumineuse du microscope comme vous le souhaitez pour l’expérience (Figure 2D).
5. Pour obtenir un enregistrement de patch, remplissez une pipette patch avec la solution interne et montez-la dans un porte-électrode. Appliquez une pression positive sur la pipette patch et abaissez-la lentement d’abord dans la solution du bain, puis sous contrôle visuel dans la tranche à l’aide du micromanipulateur.
   1. Approchez le neurone d’intérêt avec la pipette patch par le côté et le haut. Relâchez une pression positive lorsque la pipette est à la surface de la cellule (fossette visible à la surface de la cellule) et obtenez un « gigaseal » en appliquant une pression négative.
   2. Appliquez une aspiration supplémentaire pour rompre le patch de la membrane afin d’obtenir un enregistrement de la cellule entière. Par la suite, stimulez les fibres marquées avec la LED connectée en utilisant la longueur d’onde appropriée pour activer la channelrhodopsine (ChR) (470 nm) tout en enregistrant les réponses électriques de la cellule.
   3. Pour la stimulation synaptique, commencez par une faible intensité de LED et augmentez jusqu’à ce que l’amplitude de courant synaptique souhaitée soit atteinte. Déclenchez la LED en configurant les sorties numériques dans le logiciel d’acquisition de données pour contrôler la synchronisation et la durée de l’impulsion (exemples sur la Figure 3).
      Remarque : d’autres logiciels et/ou dispositifs générateurs de TTL peuvent être utilisés pour déclencher la LED.
6. Répéter la stimulation avec ouverture ouverte ou restreinte (étape 1.4) dans le trajet lumineux du microscope comme souhaité pour la cellule suivante enregistrée et/ou en présence de médicaments spécifiques.

Résultats

Graphique 1. Injections stéréotaxiques, préparation de coupes cérébrales aiguës et visualisation des fibres présynaptiques. (A, B) Injection stéréotaxique de virus. A) Photo d’une souris anesthésiée placée dans un cadre stéréotaxique avec le crâne exposé et la pipette d’injection. Encadré : Zoom avant sur l’image de la pipette d’injection remplie d’une solution virale mélangée...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)	Pour la composition, voir les références #16 et #23
Solutions de correctifs internes	Pour la composition, voir les références #16 et #23
Sulfate de magnésium heptahydraté	Roth, Allemagne	Réf. P027.1	préparer une solution mère de 2M dans de l’eau purifiée
Stéréoscope, SZX2-RFA16	Olympus, Japon
Lampe fluorescente Xcite (XI120Q-1492)	Groupe Lumen Dynamics, Canada	Référence 2012-12699
Microscope patch, BX51WI	Olympus, Japon
Amplificateur patch Multiclamp 700B	Dispositifs moléculaires, États-Unis
Digitdata 1440A	Dispositifs moléculaires, États-Unis
Logiciel PClamp, version 10	Dispositifs moléculaires, États-Unis		utilisé pour contrôler l’acquisition et la stimulation des données
Régulateur de température de bain, TC05	Luigs & Neumann, Allemagne	Tél. : 200-100 500 0145
Micromanipulateur à trois axes Mini 25	Luigs & Neumann, Allemagne	210-100 000 0010
Contrôleur de micromanipulateur SM7	Luigs & Neumann, Allemagne	Tél. : 200-100 900 7311
Capillaires en verre pour pipettes patch	World Precision Instruments, Allemagne	GB150F-8P
Papier filtre en nitrate de cellulose pour chambre d’interface	Satorius Stedim Biotech, Allemagne	13006--50----ACN
Unité LED, CoolLED pE	CoolLED, Royaume-Uni	Référence 244-1400	CoolLED ou USL 70/470 et les adaptateurs appropriés sont deux choix alternatifs pour la stimulation LED
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, Royaume-Uni	pE-ADAPTATEUR-50E
Unité LED, USL 70/470	Rapp Optoélectronique	L70-000
Adaptateur à deux ports	Rapp Optoélectronique	Renseignez-vous auprès de l’entreprise
Jeu de filtres rouge (excitation)	AHF, Allemagne	Réf. F49-560	Les filtres peuvent être achetés en kit F46-008
(séparateur de faisceau)	AHF, Allemagne	Référence F48-585
(émissions)	AHF, Allemagne	Référence F47-630
Jeu de filtres vert (excitation)	AHF, Allemagne	Référence F39-472	Alternatives : jeu de filtres F36-149 ou F46-002 (avec émission passe-bande)
(séparateur de faisceau)	AHF, Allemagne	F43-495W
(émissions)	AHF, Allemagne	Référence F76-490
LaserCheck, capteur de puissance portable	Coherent, États-Unis	1098293
Logiciel IgorPro, version 6	Wavemetrics, États-Unis		Pour l’analyse des données électrophysiologiques, d’autres progiciels alternatifs peuvent également être utilisés
Suite de macros Neuromatic pour IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com