Enregistrement d’un électrorétinogramme et d’un potentiel évoqué visuel chez un rat

Résumé

Source : Charng, J. et al. Implantation et enregistrement de l’électrorétinogramme sans fil et du potentiel évoqué visuel chez les rats conscients. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo montre comment enregistrer l’électrorétinogramme (ERG) et le potentiel évoqué visuel (VEP) chez un rat conscient. Le rat, avec des électrodes implantées chirurgicalement, est d’abord adapté à l’obscurité. Après avoir appliqué des gouttes dilatantes, l’animal est placé dans une contention et positionné dans un bol Ganzfeld. Les signaux ERG et VEP sont ensuite enregistrés.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des électrodes

Remarque : Un émetteur à trois canaux est utilisé pour l’implantation chirurgicale, ce qui permet d’effectuer simultanément 2 enregistrements d’électrorétinogramme (ERG) et 1 enregistrement de potentiel évoqué visuel (VEP). Les trois électrodes actives et les trois électrodes inactives doivent être préfabriquées en forme d’anneau avant l’implantation afin de pouvoir se fixer à l’œil. À des fins d’identification, le fabricant a enfermé les électrodes actives dans des gaines en plastique mi-blanches et mi-colorées, tandis que les électrodes inactives sont recouvertes de gaines entièrement colorées. L’électrode de masse (gaine en plastique transparent) est laissée inchangée pour toutes les électrodes actives et inactives afin d’effectuer les étapes 1.1, 1.2, 1.3 et 1.7.

1. Dévissez l’électrode en acier inoxydable à double brin à l’aide de deux pinces à pointe fine.
2. Coupez l’un des brins d’acier inoxydable (à environ 1 cm de la pointe), en laissant un seul brin droit plus long pour façonner l’électrode annulaire.
3. Repliez le brin unique en acier inoxydable sur lui-même et tournez-le en formant un anneau lisse à l’extrémité de l’électrode.
4. Pour les électrodes actives ERG, façonnez cette boucle de ~ 0,2 à 0,5 mm de diamètre en tournant la base de la boucle (dans le but décrit ici, formez deux électrodes actives de cette manière pour enregistrer l’ERG des deux yeux), et pour les électrodes ERG inactives et VEP, faites en sorte que le diamètre de la boucle soit ~ 0,8 mm de diamètre (dans cet exemple, faites cela pour une électrode VEP active et les trois électrodes inactives).
5. Accrochez l’électrode active circulaire VEP autour d’une vis en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm) de sorte que l’électrode repose contre la tête de la vis.
6. Accrochez les 3 électrodes inactives (2 ERG, 1 VEP) autour d’une deuxième vis en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm).
7. Tirez le manchon en plastique vers l’avant sur les extrémités pointues des deux brins d’acier inoxydable pour réduire l’irritation.
8. Stérilisez les émetteurs de télémétrie en les trempant dans du glutaraldéhyde à 2 % pendant plus de 10 heures à environ 25 °C. Ensuite, rincez l’émetteur avec une solution saline stérile trois fois.

2. Implantation de l’émetteur

1. Préparation des animaux
   1. Désinfectez la zone chirurgicale avant l’expérimentation en la nettoyant avec de l’éthanol à 70 %. Autoclaver tout le matériel chirurgical avant utilisation et maintenir le matériel dans de la chlorhexidine lorsqu’il n’est pas utilisé pendant la chirurgie. Couvrez l’animal avec un champ chirurgical pendant l’opération pour maintenir un environnement stérile. Assurez-vous que tous les expérimentateurs portent des masques chirurgicaux, des gants stériles et des blouses.
   2. Induire une anesthésie avec 1,5 à 2 % d’isoflurane à un débit de 3 L/min et maintenue à 1,5 à 2 % à 2 L/min tout au long de la chirurgie. Confirmer une profondeur d’anesthésie suffisante par l’absence de réflexe de pédale lors du pincement du muscle entre les orteils.
   3. Rasez une zone de 40 mm x 30 mm sur l’abdomen, du dessus de l’aine jusqu’au sternum.
   4. Rasez une zone de 30 mm x 20 mm sur le front, à l’arrière des yeux et à l’avant des oreilles.
   5. Désinfectez les deux zones rasées. Pour la région du front, désinfecter trois fois avec de la povidone iodée à 10 % (éviter d’utiliser des antiseptiques à base d’alcool pour la zone près de l’œil, conformément à la norme de pratique établie par l’Association of Surgical Technologists). Sur l’abdomen, désinfectez avec 10 % de povidone iodée et 70 % d’éthanol.
   6. Appliquez 1 goutte de proxymetacaïne sur la cornée pour une anesthésie topique supplémentaire.
   7. Appliquez 1 goutte de carboxyméthylcellulose sodique sur la cornée pour éviter le dessèchement des yeux.
2. Implantation chirurgicale
   1. Faites une incision de 10 mm sur la tête le long de la ligne médiane verticale entre les oreilles avec un scalpel chirurgical.
   2. Faites une incision de 5 mm sur l’abdomen à travers la couche de peau le long de la ligne médiane sous le sternum.
   3. Creusez une canule de 5 mm de diamètre par voie sous-cutanée entre l’incision de l’abdomen et l’incision de la tête.
   4. Faites passer les fils d’électrodes (3 actifs et 3 inactifs) de l’émetteur à travers la canule, de l’abdomen à la tête.
   5. Laissez l’électrode de référence avec la base de l’émetteur et couvrez l’extrémité de l’électrode avec de la gaze aseptique.
   6. Couvrez les pointes des électrodes (3 actives et 3 inactives) avec de la gaze aseptique.
   7. Fixez la tête du rat à une plate-forme stéréotaxique.
   8. Étendez l’incision frontale à 30 mm de longueur avec des ciseaux chirurgicaux.
   9. Exposez la zone chirurgicale en rétractant la peau lâche avec 2 sutures (3 - 0) à ~ 3 et 9 heures.
   10. Grattez le périoste recouvrant le crâne à l’aide de gaze stérilisée pour exposer les sutures bregma, lambda et médiane.
   11. Percez deux trous à travers le crâne au niveau des coordonnées stéréotaxiques actives (7 mm ventrales au bregma, 3 mm latérales à la ligne médiane) et inactives (5 mm rostral à bregma sur la ligne médiane).
   12. Fixez les électrodes actives et inactives VEP à l’aide de vis en acier inoxydable pré-fixées (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm) au crâne à l’aide d’un petit tournevis jusqu’à ~ 1 mm de profondeur dans les trous préfabriqués. Cela permet d’ancrer la vis à l’os sans endommager le tissu cortical sous-jacent.
   13. Pour implanter les électrodes actives ERG, utilisez une suture 8 - 0 pour rétracter temporairement la paupière supérieure.
   14. Insérez une canule de 16 à 21 G par voie sous-cutanée de l’arrière de l’œil jusqu’au fornix conjonctival supérieur.
   15. Retirez l’aiguille de guidage.
   16. Faites passer l’électrode active à travers le cathéter en plastique raccourci du front vers l’œil. Ensuite, retirez le cathéter en plastique.
   17. Utilisez une suture temporaire (8 - 0), qui est enfilée dans la boucle de l’électrode, pour empêcher l’électrode de se rétracter dans le tunnel.
   18. Faites une incision de 0,5 mm sur la conjonctive supérieure à 12 heures, 1 mm derrière le limbe. Utilisez une dissection émoussée pour exposer la sclère sous-jacente.
   19. Implantez une suture 8 - 0 ou 9 - 0 immédiatement derrière le limbe à mi-épaisseur sclérale.
   20. Retirez la suture temporaire de l’électrode active ERG.
   21. Ancrez l’électrode active ERG à la suture d’une demi-épaisseur sclérale en faisant 3 nœuds consécutifs, en vous assurant que la pointe de l’électrode est située près du limbe.
   22. Fermer le lambeau conjonctival à l’aide de 1 à 2 sutures interrompues (8 - 0 à 9 - 0). Assurez-vous que la conjonctive recouvre complètement l’électrode ERG pour améliorer le confort.
   23. Retirez la suture rétractable de la paupière.
   24. Répétez la procédure pour l’œil controlatéral.
   25. Appliquez du gel cyanoacrylate sur le crâne pour fixer toutes les vis en acier inoxydable et les fils d’électrode. Assurez-vous que les électrodes actives ERG ne sont pas trop serrées avant de les fixer pour permettre les mouvements oculaires.
   26. Fermez la plaie à la tête à l’aide d’une suture 3 - 0 non résorbable.
   27. Faites pivoter le rongeur pour exposer la région abdominale. Allongez l’incision cutanée abdominale à 40 mm le long de la Linea alba avec des ciseaux chirurgicaux.
   28. Faites une incision de 35 mm à travers la paroi musculaire interne pour exposer la cavité abdominale interne.
   29. À l'aide de deux sutures (3 - 0), le corps émetteur est fixé à la paroi abdominale interne du côté droit de l'animal. Évitez d’entrer en contact avec le foie.
   30. Enroulez l’électrode de terre et fixez-la dans cette forme avec une suture (3 - 0). Ensuite, placez-le flottant librement dans la cavité abdominale.
   31. Fermer le péritoine à l’aide d’une suture continue (3 - 0).
   32. Fermez l’incision cutanée à l’aide de sutures interrompues (3 - 0).
3. Soins postopératoires
   1. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Hébergez l’animal individuellement après l’opération.
   2. Administrer le carprofène par voie sous-cutanée pour l’analgésie (5 mg/kg) une fois par jour pendant 4 jours.
   3. Ajouter des antibiotiques oraux prophylactiques (enrofloxine, 5 mg/kg) à l’eau potable pendant 7 jours après la chirurgie.
   4. Appliquez une pommade anti-inflammatoire sur les sites d’incision cutanée pour réduire l’irritation pendant les 7 premiers jours après la chirurgie.

3. Effectuer des enregistrements ERG et VEP chez des rats conscients

1. Adaptation à l’obscurité de l’animal pendant 12 heures avant les enregistrements ERG et VEP.
2. Effectuer toutes les manipulations expérimentales sous un éclairage rouge tamisé (17,4 cd.m-2, λmax = 600 nm)
3. Appliquez des gouttes d’anesthésie topique (0,5 % de proxymétacaïne) et de dilatation (0,5 % de tropicamide) sur la cornée.
4. Guidez le rongeur conscient dans un dispositif de contention transparent sur mesure.
   note: La longueur de ce tube en plastique peut être ajustée pour s’adapter à des rats de différentes tailles, avec un diamètre total fixé à 60 mm. L’extrémité avant de l’appareil est effilée pour minimiser les mouvements de la tête et contient des perforations pour permettre une respiration normale. Cette face effilée permet l'alignement et la stabilisation de la tête et des yeux du rat jusqu'à l'ouverture de la sphère de Ganzfeld. Notez que le rongeur a été acclimaté au dispositif de contention (3 à 5 fois) avant la chirurgie.
5. Placez le rongeur devant le bol Ganzfeld avec les yeux alignés avec l’ouverture du bol.
6. Allumez l’émetteur à demeure en faisant passer un aimant à moins de ~ 5 cm de celui-ci. Ensuite, vérifiez que l’émetteur est allumé en vérifiant le voyant d’état LED sur la base du récepteur.
7. Collecter des signaux sur une gamme d’énergies lumineuses (c.-à-d. -5,6 à 1,52 log cd.s.m²).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bioamplificateur	ADInstruments	N° ML 135	Amplifie les signaux ERG et VEP
Carboxyméthylcellulose sodique 1,0 %	Allergan	CAS 0009000-11-7	Maintenir l’hydratation de la cornée pendant la chirurgie
Carprofène 0,5 %	Groupe de santé animale de Pfizer	N° CAS 53716-49-7	Analgésie post-opératoire, administrée avec une solution saline injectable pour la reconstitution liquidienne
Chlorhexadine 0,5 %	Laboratoires Orion	Référence 27411, 80085	Désinfection d’un instrument chirurgical
Activateur de gel cyanoacrylate	Composants RS	473 à 439	Sèche rapidement le gel cyanoacrylate
Gel de cyanocrylate	Composants RS	473 à 423	Fixez les vis en acier inoxydable au crâne
Fraise dentaire	Storz Instruments, Bausch et Lomb	E0824A	Tête de forage miniature de ~0,7 mm de diamètre pour faire un petit trou dans le crâne sur chaque hémisphère afin d’implanter des vis VEP
forer	Bosch	Série Dremel 300	Perceuse automatique pour trépanation
Enrofloxine	Laboratoires Troy		Antibiotique prophylactique post-opératoire
Sphère d’intégration de Ganzfeld	Photometric Solutions International		Stimulateur de lumière conçu sur mesure : 36 mm de diamètre, taille d’ouverture de 13 cm
Tampons de gaze	Multigate Medical Products Pty Ltd	57 à 100 milliards	Assèche l’incision chirurgicale et la surface exposée du crâne pendant la chirurgie
Isoflurane 99,9 %	Abbott Australasia Pty Ltd	NCA 26675-46-7	Nom exclusif : Isoflo(TM) Anathésique par inhalation. Anesthésique par inhalation de qualité pharmaceutique mélangé à de l’oxygène gazeux pour la chirurgie d’implant d’électrodes VEP
Pommade Kenacomb	Aspen Pharma Pty Ltd		Pour réduire l’irritation de la peau et les démangeaisons après la chirurgie
LED Luxeon	Phillips Lighting Co.		Pour la stimulation lumineuse, vingt LED de 5 watts et une LED de 1 watt, contrôlées par le logiciel Scope
Aiguille (macrochirurgie)	Instruments de précision mondiaux	501959	pour la suture de l’abdomen et de la tête, utilisé avec une suture 3-0, une aiguille à œil, un bord de coupe 5/16 cercle Taille 1, 15 mm
Porte-aiguille (macrochirurgie)	Instruments de précision mondiaux	500224	Pour tenir l’aiguille lors d’une chirurgie abdominale et cérébrale
Porte-aiguille (microchirurgie)	Instruments de précision mondiaux	Référence 555419NT	Pour tenir l’aiguille pendant la chirurgie oculaire
Cathéter Optiva	Smiths Medical International LTD	16 ou 21 g	Guident les électrodes actives cornéennes du crâne à la conjonctive
Povidone iodée 10 %	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nom exclusif : Bétadine, Antiseptique pour préparer la peau rasée à la chirurgie 10 %, 500 mL
Système d’acquisition de données Powerlab	ADInstruments	N° ML 785	Acquisition du signal de l’émetteur de télémétrie, couplé au convertisseur de données de télémétrie
Proxymétacaïne 0,5 %	Laboratoires Alcon	CAS 5875-06-9	Analgésie oculaire topique
Dispositif de contention	Confectionné		L’avant de la contention est effilé pour minimiser le mouvement de la tête, la longueur peut être ajustée pour s’adapter à différentes longueurs de rat, le diamètre total est de 60 mm.
Lame Scapel	R.G. Fournitures médicales	SNSM0206	Pour l’incision chirurgicale
Ciseaux (macrochirurgie)	Instruments de précision mondiaux	501225	pour couper les tissus sur le dos et le front
Ciseaux (microchirurgie)	Instruments de précision mondiaux	501232	Pour disséquer la conjonctive pour la fixation de l’électrode
Logiciel de portée	ADInstruments	Édition 3.7.6	Déclenche simultanément le stimulus via le système ADI Powerlab et collecte des données
rasoir	Oster	A5 doré	Raser la fourrure des zones chirurgicales
Vis en acier inoxydable	Micro-fixations	L001.003CS304	Diamètre de l’arbre de 0,7 mm, longueur de 3 mm
Cadre stéréotaxique	David Kopf	Modèle 900	Un instrument stéréotaxique pour petits animaux permettant de localiser les points de repère d’implantation sur le crâne
Champ chirurgical	Fournitures médicales vitales	GM29-612EE	Assurer un environnement stérile pendant l’opération
Suture (macrochirurgie)	Aiguilles médicales Ninbo	3-0	Pour la suture de l’abdomen et de la tête, soie stérile tressée, 60cm
Aiguille de suture (microchirurgie)	Aiguilles médicales Ninbo	8-0 ou 9-0	pour la chirurgie oculaire, y compris électrode de suture à la sclérotique et à la fermeture de la plaie conjonctivale, suture en nylon, cercle 3/8 1×5, 30cm
Convertisseur de données de télémétrie	DataSciences International	R08	Permet au signal de télémétrie de s’interfacer avec le logiciel de collecte de données
Matrice d’échange de données de télémétrie	DataSciences International		Collecte les données des émetteurs, appariement avec le récepteur
Récepteur de données de télémétrie	DataSciences International	RPC-1	Reçoit les données de télémétrie de l’émetteur
Émetteur de télémétrie	DataSciences International	F50-EEE	Émetteur de télémétrie 3 canaux
Tropicamide 0,5 %	Laboratoires Alcon		Dilatation de l’iris
Pince à épiler (macrochirurgie)	Instruments de précision mondiaux	500092	Manipuler les tissus lors d’une chirurgie abdominale et cérébrale
Pince à épiler (microchirurgie)	Instruments de précision mondiaux	500342	Manipuler les tissus lors d’une chirurgie oculaire