Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Assemblage du dispositif de microdialyse sonde-électrode
- Utilisez une électrode à deux canaux à 3 canaux (avec une longueur de coupe d’au moins 20 mm de l’électrode d’enregistrement et une électrode de mise à la terre de 10 cm de long) et couplez-la à une canule de guidage pour préparer l’appareil. Voir des exemples d’électrodes à 3 canaux et de canule de guidage pour la dialyse dans la figure 1A-1B.
- Retirez (Figure 1C) et insérez (Figure 1D) la canule de guidage métallique dans la canule en plastique factice quelques fois avant l’utilisation afin de faciliter son retrait au moment de son commutation pour sonde de microdialyse chez l’animal.
- Pliez deux fois les fils torsadés de l’électrode d’enregistrement (Figure 1E-1F) afin d’aligner les fils avec la canule factice du guide et coupez l’extrémité de l’électrode (Figure 1G) de manière à ce qu’elle soit plus longue de 0,5 mm que l’extrémité de la canule de guidage (Figure 1H) à l’aide du pied à coulisse numérique.
- Préparez le diadème en silicone de 1 mm de long (diamètre extérieur [O.D.] 2 mm, épaisseur 0,3 mm ; Graphique 1I) et insérez l’extrémité de la canule guide et l’extrémité des électrodes torsadées dans le cercle de silicium à l’aide de la pince à épiler (Figure 1J). Fixez-le sur le pied du socle de la canule de guidage à l’aide d’une colle polymère à action rapide ou de résine (Figure 1K). Voir l’exemple des appareils terminés dans les figures 1L et 2A.
- Stérilisez l’appareil sous une lumière ultraviolette germicide (UV) pendant 4 h. Retournez l’appareil quatre fois de manière à ce que chacun de ses côtés soit exposé à la lumière pendant 1 h
note: De nombreuses électrodes et sondes de microdialyse faites maison peuvent être assemblées de la même manière. La tête de l’implant pour rats décrit ci-dessus a les dimensions suivantes : 7 mm de largeur x 5 mm de profondeur x 10 mm de longueur du haut au pied du piédestal ; L’embout de l’implant mesure environ 11 mm de long, 600 μm de diamètre et tous les appareils pèsent environ 330-360 mg. Le dispositif peut être réutilisé deux ou trois fois si (i) une longueur suffisante de l’électrode de masse est laissée sur le crâne pendant l’intervention chirurgicale pour la prochaine utilisation et (ii) lorsque l’animal est tué, et que le dispositif est récupéré avec le ciment dentaire, il est laissé dans de l’acétone pendant la nuit, de sorte que le ciment puisse être désagrégé mécaniquement, et l’appareil lavé et stérilisé à nouveau.
2. Chirurgie stéréotaxique
- Utilisez un appareil stéréotaxique et un porte-clip de sonde (Figure 2B) pour l’implantation de l’appareil, conformément aux normes contemporaines pour les chirurgies aseptiques et indolores.
- Anesthésier les rats Sprague-Dawley adultes avec un mélange de kétamine/xylazine (43 mg/kg et 7 mg/kg, intrapéritonéale [i.p.]) et le fixer sur le cadre stéréotaxique. Ajouter l’anesthésie à l’isoflurane (1,4 % dans l’air ; 1,2 mL/min) à l’injection initiale de kétamine/xylazine car elle permet de contrôler la profondeur de l’anesthésie à temps. Rasez la fourrure sur la tête de l'animal.
- Frottez la surface de la peau de la tête avec une solution à base d’iode suivie d’éthanol à 70 % pour la préparer à la chirurgie aseptique.
- Implanter le dispositif de canule-électrode guide préparé en priorité (1,1 – 1,5) dans l’hippocampe ventral droit en utilisant les coordonnées suivantes : barre nasale + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm au bregma. Suivez les techniques standard pour les chirurgies stéréotaxiques.
- Assurez-vous qu’il ne recouvre pas les vis d’ancrage. Lors du montage sur l’appareil stéréotaxique, saisissez l’appareil pour la tête de la canule de guidage car elle peut être facilement alignée sur le support de sonde.
- Ancrez l’appareil au crâne à l’aide d’au moins quatre vis en acier inoxydable, en les vissant dans l’os du crâne (1 vis dans la gauche et 1 vis dans les plaques osseuses frontales droites, 1 vis dans le pariétal gauche et 1 vis dans les plaques osseuses interpariétales). Ajoutez une goutte de colle à tissu pour fixer chaque vis à l’os du crâne.
- Couvrir la moitié des filetages avec du ciment méthacrylique. Favorisez la liaison du ciment en faisant des rainures peu profondes dans l’os pour augmenter l’adhérence.
- Une fois que l’extrémité de l’appareil est positionnée dans le tissu cérébral, tordez le fil de l’électrode de terre autour de 3 vis d’ancrage. Couvrez toutes les vis montées et l’appareil avec du ciment dentaire.
- Surveillez les animaux pendant l’opération et pendant environ 1 h par la suite jusqu’à ce qu’ils soient debout et se déplacent dans la cage. Gardez-les sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Laissez les rats récupérer pendant au moins 7 jours après l’implantation du dispositif.
- Surveillez les animaux au moins une fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour détecter des signes de douleur ou de détresse. Administrer aux animaux la crème antibiotique (gentamycine 0,1 %) à proximité du site incisé pour prévenir l’infection et un analgésique (tramadol 5 mg/kg, i.p.) pendant 3 jours pour prévenir la douleur postopératoire.
3. Induction de l’épilepsie du lobe temporal par la pilocarpine et assignation des animaux à des groupes expérimentaux
- Après une semaine de récupération post-chirurgicale, répartissez les animaux au hasard en groupes : (i) animaux témoins recevant le véhicule et (ii) animaux épileptiques recevant de la pilocarpine. Utilisez un nombre proportionnellement plus élevé d’animaux pour le groupe épileptique, car tous les rats administrés à la pilocarpine ne développeront pas la maladie.
- Injecter une dose de méthylscopolamine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) et 30 min après, une injection unique de pilocarpine (350 mg/kg, i.p.) pour induire l’état de mal épileptique (SE). Injecter de la méthylscopolamine et le véhicule (solution saline) aux rats témoins. Utilisez une seringue de 1 ml avec une aiguille de 25 g pour toutes les administrations de biothérapie.
- Vérifiez visuellement les animaux pour qu’ils commencent à avoir des crises comportementales (déplacement des vibrisses dans les 5 minutes, hochement de tête, clonage des membres) et dans les 25 minutes pour cloner en continu tout le corps (SE).
- Arrêter l’ES 2 h après le début de l’apparition pour avoir une mortalité d’environ 25 % et une période de latence moyenne d’environ 10 jours par l’administration de diazépam (20 mg / kg, i.p.). Observez et enregistrez tout comportement convulsif commençant immédiatement après l’injection de pilocarpine et continuez pendant au moins 6 heures par la suite.
- Administrer aux animaux une solution saline (1 ml, i.p.) à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 25 G et une solution de saccharose (1 mL, p.o.) à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille d’alimentation flexible de 17 G pendant 2 à 3 jours après l’ES pour favoriser la récupération de la perte de poids corporel.
- Exclure de l’étude les animaux qui n’atteignent pas leur poids corporel initial dans la première semaine après l’ES de la pilocarpine (à l’exception du groupe en phase aiguë tuée 24 h après l’ES, où le suivi du poids corporel n’est pas possible).
- Répartissez au hasard les animaux post-SE en différents groupes expérimentaux (Figure 3) : phase aiguë (où la microdialyse a lieu 24 h après l’ES), latence (7 à 9 jours après l’ES), première crise spontanée (environ 11 jours après l’ES) et période chronique (commence environ 22 à 24 jours après l’ES, c’est-à-dire environ 10 jours après la première crise). Surveiller les animaux pour détecter l’apparition de crises spontanées.
note: Utiliser les critères d’inclusion/exclusion suivants pour d’autres expériences chez des rats épileptiques : développement d’une SE convulsive dans l’heure suivant l’administration de pilocarpine ; prise de poids dans la première semaine après l’ES et le bon positionnement de la sonde et de l’électrode de microdialyse.
4. Surveillance et analyse du comportement épileptique
- Surveillance à long terme du comportement épileptique
- Environ 6 h après l’administration de la pilocarpine (c’est-à-dire à la fin de l’observation directe par les chercheurs), placez les animaux dans les cages propres de la maison et commencez la surveillance vidéo 24 heures sur 24.
- Continuez la surveillance vidéo 24 heures sur 24 jusqu’au 5e jour, à l’aide d’un système de vidéosurveillance numérique.
- À partir du jour 5, connectez les rats dans leurs cages rectangulaires à un système d’enregistrement EEG captif et poursuivez la surveillance vidéo 24 heures sur 24.
- Réglez les paramètres sur l’amplificateur positionné à l’extérieur de la cage de Faraday (réglez le facteur d’amplification sur chaque canal en fonction de la spécificité du signal EEG de chaque animal) et démarrez l’acquisition de l’EEG en observant le signal EEG produit par des câbles non connectés. Utilisez une fréquence d’échantillonnage de 200 Hz et un filtre passe-bas réglé sur 0,5 Hz.
- Connectez l'animal à des câbles tenant la tête d'un animal entre deux doigts tendus d'une main et vissant les connecteurs au socle d'électrodes avec l'autre main libre. Lancez l’acquisition.
prudence: Assurez-vous que le signal est exempt d’artefacts. Les artefacts courants sont des pointes dépassant largement l’échelle.
- Un jour avant l’expérience de microdialyse, transférez les animaux dans le système EEG captif équipé de cylindres en plexiglas pour la microdialyse. Débranchez les animaux du système d’attache EEG dans la cage domestique en vissant les connecteurs de l’électrode sans retenir l’animal. Placez l’animal dans les hauts cylindres en plexiglas.
