Article de méthode

Enregistrement des potentiels postsynaptiques excitateurs du champ neuronal dans des coupes aiguës de l’hippocampe

8 juillet 2025

Dans cet article

Résumé

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Source : Weng, W., et al. Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches aiguës d’hippocampe maintenues dans un système de chambre de type recyclage, perfusion et submersion de petit volume. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre la procédure de mise en place d’une tranche de cerveau dans une chambre d’immersion pour enregistrer l’activité synaptique. Le processus consiste à fixer la tranche sur du papier lentille, à maintenir un flux continu de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) pour assurer la viabilité neuronale et à positionner avec précision les électrodes de stimulation et d’enregistrement par rapport à une région cérébrale d’intérêt spécifique. Cette configuration permet un suivi précis de l’activité synaptique de base et des effets de la stimulation électrique.

Protocole

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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Enregistrement des réponses synaptiques dans une chambre de coupe par immersion

NOTE : Voir le tableau des matériaux .

  1. Préchauffez la solution d’aCSF dans un bain-marie à environ 28-30 °C (cela évitera la formation de bulles dans la chambre d’enregistrement).
  2. Démarrez le système de recyclage (4-5 mL/min) et activez le chauffage en ligne pour équilibrer le système pendant au moins 1 h.
  3. Prétrempez un petit morceau de papier de nettoyage d’objectif et un treillis en nylon fixé sur un fil de platine en forme de U dans la chambre de tranche d’immersion pendant quelques minutes (Figure 1).
  4. Retirez le fil de platine en forme de U.
  5. Arrêtez le recyclage et placez une tranche sur le papier de nettoyage de l’objectif.
  6. Placez immédiatement le treillis de maintien de la tranche sur la tranche, allumez la pompe et laissez la tranche s’équilibrer pendant 30 minutes sans plonger l’objectif dans l’aCSF.
  7. Remplissez la micropipette en borosilicate (, c’est-à-dire l’électrode enregistreuse) avec de l’aCSF (résistance de la pointe : 1-2 MΩ, remplie 1/3 avec de l’aCSF) et montez-la dans le porte-pipette.
  8. Placez l’électrode de stimulation en tungstène isolée à l’époxy testée dans le support du manipulateur et les fils de référence dans la chambre de tranche.
  9. Ajoutez une deuxième électrode de référence à la chambre et connectez-la à la prise de référence de la tête de l’électrode d’enregistrement (Figure 1A).
  10. Dans le logiciel de contrôle de l’amplificateur, cliquez sur la case « mode pince zéro » et continuez en double-cliquant sur la case « liste de gain de sortie ». Choisissez un gain de « 100 », double-cliquez sur la « boîte de liste de filtre passe-haut (Bessel) », choisissez « 0,1 Hz » et double-cliquez sur la « zone de liste de filtre passe-bas (AC) » pour choisir « 3 kHz"
  11. Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur "Acquérir | Choisissez un protocole dont les paramètres permettent des stimulations épisodiques et la numérisation de potentiels amplifiés à 10-20 kHz pendant 50-100 ms et qui déclenche automatiquement un isolateur de stimulus 10 ms après le début d’un enregistrement épisodique.
  12. Placez les électrodes de stimulation et d’enregistrement en ligne et parallèlement à la couche pyramidale, par exemple (Figure 1B et Figure 2).
  13. Cliquez sur « Acquérir | Modifier le protocole » et choisissez l’onglet « déclencheur » (dans la fenêtre contextuelle). Cliquez sur la case « source du déclencheur » et choisissez « barre d’espace » comme source du déclencheur. Cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton « enregistrer » pour démarrer l’acquisition et notez la fenêtre contextuelle avec un bouton de déclenchement.
  14. Dans le logiciel d’isolateur de stimulus, cliquez sur la case « contrôle de tension » et entrez « 0 ». Cliquez sur le bouton « télécharger ». Cliquez sur la fenêtre « logiciel d’enregistrement » et appuyez sur la barre d’espace. Répétez ce cycle en saisissant séquentiellement des valeurs de 1 à 8, par exemple, par pas de 1 mV dans la case « contrôle de tension ».
  15. Corrélez la force de stimulation avec les valeurs de pente fEPSP et déterminez la force de stimulation nécessaire pour obtenir 40 % de la pente maximale de la fEPSP. Cliquez sur la « case de contrôle de tension » et entrez la valeur déterminée. Cliquez sur le bouton « télécharger ».
    REMARQUE : Un isolateur de stimulus est utilisé pour appliquer de brèves impulsions de tension ou de courant au tissu cérébral. Les impulsions biphasiques peuvent avoir 100 μs par phase.
  16. Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur le bouton d’arrêt puis sur le menu « Acquérir ». Cliquez sur « Modifier le protocole » et choisissez l’onglet « Déclencheur » dans la fenêtre contextuelle. Cliquez sur la case de la source du déclencheur et choisissez le « minuteur interne » comme source du déclencheur. Cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton d’enregistrement qui lance l’enregistrement automatique des potentiels de champ toutes les 30 s, par exemple. Cliquez sur le bouton « arrêter » après 30-60 min.
  17. Cliquez sur le menu « Acquérir », cliquez sur « Ouvrir le protocole », choisissez le protocole d’induction de plasticité synaptique souhaité, et cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton « enregistrer » pour activer automatiquement la stimulation et l’enregistrement à haute fréquence. Cliquez sur le bouton « stop ».
    REMARQUE : Dans le cas d’études relatives à la plasticité synaptique, appliquez l’un des paradigmes d’induction standard pour la potentialisation à long terme ou la dépression à long terme après un enregistrement de base prolongé. Des exemples représentatifs de la modulation résultante de la transmission synaptique sont représentés dans Figure 4 et Figure 5.
  18. Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur « Acquérir | Ouvrez le protocole" et choisissez le même protocole qu’à l’étape 4.12. Cliquez sur le bouton « OK », puis sur « enregistrer ». Continuez à exécuter automatiquement les enregistrements potentiels sur le terrain pendant 2 à 4 h, par exemple. Cliquez sur le bouton « arrêter » pour terminer l’enregistrement.
  19. Dans le cas d’études pharmaceutiques, appliquer le composé directement dans le réservoir d’aCSF si une administration permanente du composé est souhaitée (Figure 3).

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Résultats

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figure-results-1
Figure 1 : Composants de la carbogénation à écoulement sortant pour des expériences dans une chambre de coupe par immersion. (A) Présentation de la chambre de tranche d’immersion. Le fil de platine en forme de U avec des fibres de nylon retenant une tranche d’hippocampe est représenté. Les fils d’argent ont été enroulés autour d’une petite canule, créant une bobine pour augmenter la...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipements et matériaux d’électrophysiologie
Extracteur de pipette verticalNarishige, JaponPC-10
Table d’isolation des vibrationsMeirits, JaponADZ-A0806
Chambre d’enregistrement de type immergéWarner InstrumentsRC-26GLP
Bain-marie thermostatiqueZhongcheng Yiqi, ChineHH-1
Micromanipulateur 4 axesSutter, États-UnisMP-285, MP-225
Fil de platineInstruments de précision mondiauxPTP406
amplificateurDispositifs moléculaires, États-UnisMulticlamp 700B
Système d’acquisition de donnéesDispositifs moléculaires, États-UnisDigidata 1440A
Logiciel d’analyseDispositifs moléculaires, États-UnisClampex 10.2
Microscope à fluorescenceNikon, JaponFN1
Source lumineuse LEDGroupe Lumen Dynamics, CanadaX-cite 120LED
MicropipettesAppareil de HarvardGC150TFEnregistrement extracellulaire
Micropipettes en borosilicateSutter, États-UnisBF150-86pince de patch
Électrode de tungstèneA-M Systems, États-UnisRéférence 575500
Pompe péristaltiqueLonger, ChineBT00-300T
Tubes pour pompe péristaltiqueISMATEC, Wertheim, AllemagneRéf. SC03091x entrée, ID : 1,02 mm
Tubes pour pompe péristaltiqueISMATEC, Wertheim, AllemagneRéf. SC03192x tubes pour l’écoulement, ID : 2,79 mm
Caméra CCDPCO, Allemagnepco.edge sCMOS
Papier de nettoyage des verresKodak
Tube à centrifuger conique de 50 mlThermo scientifique339652
PréchambreWarner InstrumentsBSC-PC
Chauffage en ligneWarner InstrumentsSF-28
Régulateur de températureWarner InstrumentsTC-324B
Réactifs nécessaires
NaClRéactif chimique Sinopharm,
Chine		10019318
KclRéactif chimique Sinopharm,
Chine		10016318
KH2PO4Réactif chimique Sinopharm,
Chine		10017618
MgCl2·6H2ORéactif chimique Sinopharm,
Chine		10012818
CaCl2Réactif chimique Sinopharm,
Chine		10005861
NaHCO3Réactif chimique Sinopharm,
Chine		10018960
glucoseRéactif chimique Sinopharm,
Chine		10010518
NaH2PO4Réactif chimique Sinopharm,
Chine		20040718
HEPES sigma N° H3375
Pyruvate de sodium sigma A4043
MgSO4Réactif chimique Sinopharm,
Chine		20025118
NaOHRéactif chimique Sinopharm,
Chine		10019718

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Mots-clés

Tranche hippocampiqueEPSP de champchambre d immersionliquide c phalorachidien artificiellectrode de stimulationlectrode d enregistrementenregistrement lectrophysiologiquetransmission synaptiqueexcitabilit neuronalepr paration de tranches de cerveau

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