Enregistrements électrophysiologiques de préparations du tronc cérébral et de la moelle épinière d’un rongeur nouveau-né

Résumé

Source : Rousseau, J., et al. Electrophysiology on Isolated Braintron-spinal Cord Preparations from Newborn Rongeurs permet l’enregistrement de la sortie du réseau neuronal respiratoire. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo présente des enregistrements électrophysiologiques de préparations isolées du tronc cérébral et de la moelle épinière de rongeurs nouveau-nés. La préparation est placée dans une chambre d’enregistrement, et les sursauts inspiratoires du tronc cérébral sont enregistrés dans des conditions oxygénées et privées d’oxygène à l’aide de la quatrième racine nerveuse ventrale de la moelle épinière.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Installation et préparation

1. Solutions
   1. Préparez des solutions mères de liquide céphalo-rachidien artificiel (LCR-A) selon les recettes suivantes. D’autres recettes avec des variations de concentration sont disponibles dans la littérature. Conservez les solutions mères à 4 °C pendant un mois maximum.
      1. Solution saline : ajouter 75,39 g de NaCl (129 mM final), 2,5 g de KCl (3,35 mM final), 0,81 g de NaH₂PO4 (0,58 mM final), 2,33 g de MgCl₂ (1,15 mM final), 1,85 g de CaCl₂ (1,26 mM). Dissoudre dans 800 ml d’eau distillée puis remplir à 1 L d’eau distillée.
      2. Solution bicarbonatée : ajouter 17,65 g de NaHCO₃ (21 mM final). Dissoudre dans 900 ml d’eau distillée puis remplir à 1 L d’eau distillée. Les variations de la concentration en bicarbonate entraîneront des variations de pH.
      3. Solution de glucose : ajouter 54,06 g de glucose (30 mM final). Dissoudre dans 400 ml d’eau distillée puis remplir à 500 ml d’eau distillée.
   2. Préparez le LCR en diluant 100 ml de solution saline, 100 ml de solution de bicarbonate et 50 ml de solution de glucose dans 1 L d’eau distillée. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
   3. Préparez une électrode de verre en chauffant et en étirant un tube de verre jusqu’à ce qu’il se brise. Poncez la pointe avant utilisation. L’électrode peut être réutilisée plusieurs fois tant qu’elle reste propre.
2. Dispositif expérimental
   note: Les détails de la configuration sont présentés à la figure 1.
   1. Allumez l’amplificateur, la moyenne mobile, le système d’acquisition de données, le régulateur de température et la pompe. Vérifiez l’amplification du signal (gain = 10 000), la filtration (seuil bas, 10 Hz ; seuil haut, 5 kHz) et la fréquence d’échantillonnage de la conversion analogique-numérique du signal brut (2,5 kHz).
   2. Remplissez une bouteille d’aCSF et faites-la bouillir avec du carbogène (95 % O₂, 5 % CO₂). Induire un écoulement de CSF à bulles et réchauffé dans la chambre d’enregistrement (volume 5 ml) à 4 ml/min. Maintenez la température dans la chambre d’enregistrement à 26 (± 1) °C. Le pH doit être de 7,4 dans ces conditions standard.
   3. Conservez 50 ml de LCSa à température ambiante (RT) et à bulles de carbogène dans une seringue de 50 ml près de la chambre de dissection.
   4. Allumez l’ordinateur et démarrez le logiciel d’enregistrement.

2. Dissection

1. Pesez et déterminez visuellement le sexe de l’animal (les mâles ont une distance anogénitale plus longue, tandis que les femelles ont une courte distance anogénitale ; les organes génitaux mâles sont souvent foncés tandis que les organes génitaux féminins sont roses).
2. Anesthésie les rongeurs nouveau-nés par l’une des options suivantes : cryoanesthésie (immersion complète de l’animal dans la glace pendant 4 à 5 min), injection (équitensine à 4 ml/kg) ou inhalation d’anesthésiques volatils (isoflurane ou éther). Confirmer un plan d’anesthésie adéquat par l’absence de réflexe de retrait de la patte.
3. Placez l’animal sur le banc, ventral, face cachée. Sectionnez la partie rostrale de la tête par voie coronaire à l’aide d’un scalpel au niveau du bregma (visible à travers la peau et le crâne). Effectuez cette étape immédiatement après l’anesthésie de l’animal.
4. Sectionnez le corps coronalement avec un scalpel sous les membres antérieurs.
5. Enlever la peau, les muscles, les tissus adipeux et le viscère à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces fines. Comme les os sont mous à cet âge, veillez à ne pas endommager le système nerveux. Effectuez cette étape sur le banc.
6. Placez la préparation dans la chambre de dissection. Utilisez l’aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation. À partir de ce moment jusqu’à la fin de l’enregistrement, utilisez un microscope.
7. Sur la face dorsale de la préparation, coupez le crâne et les vertèbres du rostral à la partie caudale le long de l’axe moyen avec des ciseaux chirurgicaux et des ciseaux et des pinces minces. Ouvrez le crâne et les vertèbres coupés afin d’exposer le tissu nerveux. Utilisez l’aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation.
8. À l’aide de la pince, retirez la membrane arachnoïdienne, un tissu mince recouvrant la surface du tissu nerveux. Conservez la pie-mère et les vaisseaux sanguins contre le tissu nerveux. Utilisez l’aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation.
9. Placez la préparation avec la face dorsale vers le bas et abaissez soigneusement le tronc cérébral et la moelle épinière en coupant les nerfs et le tissu conjonctif avec les ciseaux tout en maintenant la préparation en place. Une approche dorsale est également possible. Gardez les racines et les nerfs le plus longtemps possible. Retirez les os pour isoler le tronc cérébral et la moelle épinière. Utilisez l’aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation.
10. Retirez le cervelet et les structures rostrales restantes en les sectionnant avec le scalpel. Utilisez l’aCSF stocké dans l’aiguille pour oxygéner la préparation.
11. En option, selon la conception de l’expérience, retirer les boutons avec le scalpel par une section coronale antérieure à l’artère cérébelleuse inférieure. Notez que garder le pont entier ralentira le rythme chez les rats et l’inhibera complètement chez les souris. Les préparations qui n’incluent que la partie caudale du pont présentent une activité semblable à celle de la respiration avec une fréquence stable à la racine C4.

3. Enregistrement

1. Placez la préparation dans la chambre d’enregistrement, face ventrale vers le haut. Fixez la préparation avec des broches dans la partie la plus basse de la moelle épinière et la partie la plus rostrale du tronc cérébral.
2. À l’aide d’une seringue reliée à l’électrode par son aiguille, induire une dépression de l’électrode (diamètre de l’embout en verre : 150 - 225 μm) en tirant sur le piston de la seringue, afin de remplir partiellement l’électrode d’aCSF.
3. À l’aide d’un micromanipulateur, placez soigneusement l’électrode près de l’une des quatrièmes racines ventrales. D’autres racines ventrales peuvent également présenter une activité semblable à celle d’une respiration (par exemple, le nerf crânien XII, la racine ventrale C1).
4. Induisez une dépression dans le réservoir de l’électrode via la seringue en tirant sur le piston afin d’aspirer doucement la radicelle nerveuse. Déplacez ensuite délicatement l’électrode pour l’appliquer contre la moelle épinière.
   note: Idéalement, la taille de la radicelle correspond à la taille de l’ouverture de l’électrode et crée ainsi une étanchéité entre les compartiments interne et externe de l’électrode. Étant donné que les amplificateurs différentiels sont couramment utilisés pour de tels enregistrements, toute ouverture entre l’intérieur de l’électrode et la chambre d’enregistrement réduit la qualité du signal et rend difficile l’élimination du bruit de fond.
5. Démarrez l’enregistrement.
6. Noter le rythme produit par la préparation dans des conditions normoxiques (c.-à-d. aLCR bouillonné avec du carbogène : 95 % O₂ et 5 % CO₂) pendant au moins 20 min pour déterminer les paramètres de base de la préparation.
7. Passer de l’aCSF à bulles de carbogen au stimulus aCSF (c.-à-d. à bulles avec 95 % de N₂ et 5 % de CO₂ pour le stimulus d’hypoxie) pendant 15 min. Modifier la durée d’exposition en fonction du protocole expérimental. Enregistrez la durée d’exposition sur l’enregistrement et la fiche technique de l’animal. Dans la mesure du possible, utilisez des tubes en acier inoxydable entre la bouteille d’aCSF et la chambre pour éviter la diffusion de gaz vers l’extérieur du tube.
8. Repassez la perfusion à l’aCSF standard à bulles de carbogen pendant au moins 15 minutes pour un enregistrement de récupération. Enregistrez-le sur l’enregistrement et la fiche technique de l’animal.
9. Terminez l’enregistrement.

Résultats

Figure 1. Schéma récapitulatif de la configuration.L’aCSF à bulles est réchauffé et envoyé par une pompe dans la chambre d’enregistrement. L’excès de LCR dans la chambre d’enregistrement est aspiré par une pompe et éliminé. La chambre d’enregistrement est reliée au sol et au régulateur de température. La sortie de l’électrode est directement relayée à l’amplificateur, puis au moyen mobile et a...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sylgard	Sigma Aldrich	Référence 761036-5EA	Utilisation sous la capuche
NaCl	Boutique bio	Réf. SOD002
Kcl	Boutique bio	Réf. POC888
CaCl2	Boutique bio	CCL444
MgCl2	Boutique bio	MAG510
NaHCO3	Boutique bio	SOB999
NaH2PO4	Boutique bio	SPM306
D-glucose	Boutique bio	GLU501
Carbogène	Linde	Référence 343-02-0006
Régulateur de température	Warner Instruments, Hamden, CT, États-Unis	TC-324B
Électrode d’aspiration	A-M Systems, Everett, WA, États-Unis	Modèle 573000
Amplificateur différentiel à courant alternatif	A-M Systems, Everett, WA, États-Unis	Modèle 1700
Moyenne mobile	CWE, Ardmore, Pennsylvanie, États-Unis	modèle MA-821
Système d’acquisition de données	Dataq Instruments, Akron, OH, États-Unis	modèle DI-720
Logiciel LabChart	ADInstruments, Colorado Springs, CO, États-Unis
Logiciel de prisme	Graphpad, La Jolla, CA, États-Unis
Chambre d’enregistrement	Fait maison
base	Kanetec, Bensenville, IL, États-Unis
Micromanipulateur	World Precision Instrument Inc., Sarasota, Floride, États-Unis	Mo
base	Kanetec, Bensenville, IL, États-Unis	KITE-R
Pompe péristaltique	Gilson, Middleton, WI, États-Unis	Mo
Cage de Faraday	Fait maison	MINIPULS 3
ordinateur