Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation chirurgicale
- Nettoyez et préparez l’émetteur pour assurer une chirurgie sûre et stérile. Retirez l’émetteur de son emballage antistatique et vaporisez ou trempez-le dans de l’éthanol à 70 %. Rincez l’émetteur avec une solution saline stérile et placez-le entre des éponges de coton stériles imbibées de solution saline stérile ou conservez-le immergé dans une solution saline stérile.
- Collecter et stériliser les outils nécessaires à la chirurgie, autoclave à vapeur pour la stérilisation. Voir le tableau des matériaux et des réactifs pour la liste des outils chirurgicaux.
2. Implantation chirurgicale
- Anesthésier les animaux et maintenir l’anesthésie selon le protocole approuvé par l’IACUC. Au début de l’étude et pendant l’opération, vérifiez le réflexe de pincement de l’orteil toutes les 15 minutes. L’absence de réponse indique un niveau d’anesthésie suffisant.
- Pour les chiots, utilisez une anesthésie par l’isoflurane (4 %) avec O2 (100 %). Pour les adultes, utilisez de la kétamine (100 mg/kg) avec de la xylazine (10 mg/kg).
- Position fixe dans le cadre stéréotaxique. Placez les embouts de la barre d’oreille dans le méat auditif. Ne serrez pas excessivement les barres d’oreille car le crâne est très mou chez les jeunes rats. Fixez le cône nasal d’anesthésie.
- Gardez l’animal au chaud pendant l’opération en le plaçant sur le coussin chauffant réglé à 37 °C. Chez les animaux adultes, appliquez une pommade lubrifiante sur les yeux de l’animal.
- Stérilisez le site d’incision et maintenez le champ chirurgical stérile.
- Frottez le cuir chevelu avec des applications alternées d’éthanol à 70 % et de bétadine. Commencez au centre du cuir chevelu et faites des cercles concentriques de plus en plus larges.
- Couvrez l’animal avec un champ et effectuez l’opération sur l’animal drapé. Maintenir le champ opératoire stérile en tapissant le dispositif chirurgical avec des champs stériles, du matériel de pulvérisation avec de l’éthanol à 70 %.
- Portez des gants chirurgicaux stériles et une blouse (ou selon les exigences de l’établissement). Pour aider à maintenir un champ stérile, utilisez un assistant chirurgical.
- Faites une incision sur le cuir chevelu de l’animal légèrement derrière les yeux le long de la ligne médiane, environ 2 cm. Soyez prudent lors de l’insertion du scalpel car le crâne est encore très mou chez les jeunes rats. Faites une seule incision pour que l’incision saigne moins et guérisse plus rapidement.
- Exposez le crâne. Préparez une zone propre et sèche pour maximiser le lien entre l’émetteur et les os du crâne. Utilisez des pinces à anévrisme pour saisir le cuir chevelu.
- Tirez doucement le cuir chevelu loin de la ligne médiane aux quatre coins. Recherchez des repères anatomiques tels que bregma et lambda dans le crâne. N’oubliez pas que les os du crâne ne sont pas fusionnés chez les animaux à cet âge. Utilisez l’atlas des coordonnées stéréotaxiques de Paxinos pour trouver l’emplacement correct du trou de bavure.
- Utilisez un outil de type Dremel avec un foret de type bavure. Créez deux trous de bavure dans les positions d’enregistrement souhaitées, les trous ayant un diamètre supérieur à 300 μm. Placez le trou de bavure de l’électrode de référence sur le cervelet derrière le lambda du crâne.
- Assurez-vous que les fils de l’émetteur sont alignés avec les trous de bavure. Si les fils des électrodes ne sont pas alignés, la contamination des électrodes par la colle est probable et entraînera un signal de mauvaise qualité. Pour aligner les fils, vérifiez l’ajustement de l’émetteur et pliez doucement les électrodes pour les aligner sur les sites prévus pour les trous de bavures.
- Coupez les fils d’électrode. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper les électrodes à la longueur souhaitée. La profondeur des électrodes est importante pour le type d’enregistrement requis pour l’expérience (c’est-à-dire placer les électrodes au-dessus de la dure-mère pour les enregistrements EEG, ou utiliser des coordonnées stéréotaxiques pour des structures cérébrales définies).
- Appliquez généreusement du cyanoacrylate sur la base de l’émetteur pour couvrir la zone en veillant à éviter de recouvrir les électrodes. La colle cyanoacrylate est un isolant électrique, la contamination des électrodes avec de la colle n’entraînera aucun signal.
- Si vous enregistrez à partir de structures cérébrales profondes, montez l’émetteur sur le support de canule et placez-le dans le bras stéréotaxique pour le contrôle de l’axe z. Abaissez l’émetteur à l’aide du bras stéréotaxique à la profondeur appropriée et placez du gel cyanoacrylate autour de l’émetteur.
- Séchez soigneusement le crâne avant de placer l’émetteur pour assurer une forte adhérence. Appliquer l’émetteur enduit de cyanoacrylate sur le crâne. Prenez soin d’aligner les électrodes avec les trous de bavure correspondants.
- Essayez d’éviter d’endommager les principales structures vasculaires. Maintenez l’émetteur en place avec une légère pression pendant une minute. Utilisez une légère pression pour former une liaison solide entre l’émetteur et le crâne.
- Appliquez du cyanoacrylate supplémentaire, suffisamment pour sceller complètement l’interface émetteur/crâne. Pour assurer un bon ajustement et une liaison solide, maximisez la surface de la colle qui entre en contact avec le crâne. Appliquez l’adhésif cyanoacrylate en cercle autour de l’émetteur, en vous assurant que le crâne et la paroi de l’émetteur sont couverts.
- Appliquez un accélérateur chimique (0,1 ml) à l’aide d’une seringue autour du cyanoacrylate à la base de l’émetteur implanté. Utilisez l’accélérateur avec parcimonie, en prenant soin de ne pas l’appliquer sur les tissus adjacents.
note: L’accélération chimique du durcissement du cyanoacrylate garantit que la liaison forte entre l’émetteur et le crâne se forme rapidement. L’accélérateur cyanoacrylate est utile pour accélérer le durcissement de l’adhésif, mais n’est pas nécessaire.
- Retirez l’accélérateur en lavant soigneusement la zone avec une solution saline stérile. L’accélérateur de cyanoacrylate peut provoquer une irritation des tissus s’il n’est pas lavé de la zone de l’incision. Pour laver la zone, remplissez une seringue de 1,0 ml avec une solution saline stérile et irriguez la zone à l’aide d’une aiguille de seringue. En général, 0,5 ml de solution saline suffit pour laver l’accélérateur.
- Suturez la peau autour de la base de l’émetteur, mais ne couvrez pas l’émetteur. Le haut de l’émetteur doit être au-dessus de la peau pour transmettre efficacement les signaux neuronaux. La peau doit être raisonnablement serrée autour de l’émetteur et la colle autour de l’appareil. Utilisez du Vicryl ou une suture en soie (fil doux) ; La peau des animaux immatures est molle et s’abîme facilement si des sutures souples ne sont pas utilisées. Pour les animaux adultes, utilisez n’importe quel matériel de suture.
- Retirez l’animal du cadre stéréotaxique et placez-le sur une couverture chauffante pour le récupérer.
- Assurez-vous que les animaux sont au chaud (37 °C) et ambulatoires (c.-à-d. complètement rétablis) avant de retourner à la mère. Assurez-vous que l'animal est hydraté en pinçant la peau sur le dos de l'animal (si l'animal est déshydraté, la peau restera déformée). Si l'animal est déshydraté, administrer une injection sous-cutanée de tampon de Ringer lacté. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
- Administrer de la buprénorphine (0,05 mg/kg) aux animaux pour la gestion de la douleur post-chirurgicale et une injection sous-cutanée de 0,1 ml de bupivacaïne autour du site d’injection.
note: Du début à la fin, l’ensemble de la procédure doit être terminé en 5 à 10 minutes pour les animaux de cet âge (6e jour postnatal). Le temps chirurgical peut prendre plus de temps pour les animaux plus âgés.
3. Soins et logement
Remarque : Certaines mères peuvent ne pas tolérer les petits implantés avec l’appareil. Il peut être nécessaire de choisir des mères tolérantes. Il est acceptable pour la mère de déplacer les petits autour de la cage en les ramassant par l’émetteur.
- Une fois les animaux sevrés, placez-les individuellement pour éviter que les appareils ne soient retirés de leur compagnon de cage.
- Euthanasier les animaux à l’aide d’une dose létale de pentobarbital (25 mg/kg) ou d’isoflurane (dans un bocal à cloche) en présence de signes de détresse.
- Remarque : certaines cages d'élevage avec des inserts métalliques peuvent interférer avec les émetteurs implantés. Assurez-vous de vérifier la hauteur de l'insert métallique pour vous assurer que les animaux ne peuvent pas coincer l'émetteur entre les « barreaux » de l'insert métallique.
4. Enregistrement de l’EEG
- Placez l’animal dans une cage seul ou co-logé avec les compagnons de portée et la mère. Cependant, ne placez qu’un seul animal implanté dans une seule cage. Ne laissez pas les petits seuls dans la chambre d’enregistrement pendant plus de 2 heures. Surveillez les animaux pour détecter des signes de détresse et de déshydratation.
- Connectez l’alimentation fournie à la base du récepteur et vérifiez que le voyant d’alimentation est allumé. Connectez la base du récepteur à un système d’acquisition de données à l’aide de câbles BNC (Bayonet Neil-Concelman).
- Placez la cage de l’animal sur la base du récepteur (Figure 1). Le voyant « signal » doit s’allumer pour indiquer qu’un émetteur a été détecté. Les données peuvent maintenant être enregistrées.
- Pour enregistrer des données, connectez la base du récepteur à un convertisseur analogique-numérique et connectez le convertisseur à un ordinateur (Figure 2).
- Réglez le taux d’échantillonnage de l’enregistrement. Assurez-vous que les données sont correctement échantillonnées. Sélectionnez une fréquence d’échantillonnage d’au moins 250 Hz (500 Hz recommandés) pour l’enregistrement (la bande passante de l’émetteur est de 0,1 à 100 Hz).
- Enregistrez des données numérisées et analysez-les à l’aide de progiciels de traitement du signal tels que Matlab.
