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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Configuration pour la découpe de tranches de cerveau
- Préparer une solution de coupe composée de (mM) de 125 choline-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 D-glucose saturé de gaz carbogène (95 % O2–5 % CO2) et une solution d’enregistrement de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) composée de (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 D-glucose, saturé en carbogène. Placez la solution de coupe sur de la glace pour la garder froide.
- Congelez environ 400 ml de la solution de coupe et mélangez-la avec 100 ml de solution de coupe non congelée pour créer une boue de glace. Buller avec du carbogène (95 % O2–5 % CO2) à un débit d’environ 0,5 L/min à travers des tubes de petit calibre ou du verre fritté pour produire un flux régulier mais doux de bulles.
- Préparez un bécher de 250 ml avec un insert en maille de nylon en relief sur lequel seront placées les tranches de cerveau. Remplissez d’aCSF pour couvrir la maille d’environ 2 cm et bullez de carbogène, en veillant à ce que les bulles ne perturbent pas directement la zone de maintien de la tranche. Il est également important qu’il n’y ait pas de bulles d’air dans le treillis en nylon, donc s’il y en a, retirez-les. Ce sera la chambre de rétention et sera maintenue à RT (20 - 25 °C).
- Disposez les instruments de dissection avec une grande paire de ciseaux, une petite paire de ciseaux, des micro-spatules petites et grandes et des paires de pinces et mettez-les froides sur de la glace. Placez le bloc de coupe de tissu vibratome sur de la glace sur un carré de papier d’aluminium. Obtenez 2 morceaux de papier filtre de 6 cm, une lame de rasoir à un seul tranchant et un bécher de 25 ml rempli également de boue de solution de coupe.
- Remplissez un deuxième récipient de glace, posez un morceau de papier de soie sur la glace et placez un plat de culture de 12 cm sur le dessus. Remplissez le plat de culture avec de la boue de glace de solution de coupe et bullez de carbogène. C’est le récipient dans lequel la dissection cérébrale doit être effectuée.
- Préparez le vibratome. Retirez une lame de rasoir fraîche à double tranchant (utilisez une lame neuve à chaque fois) de son emballage et vaporisez de l’éthanol à 80 % puis de l’eau déminéralisée. Coupez une pipette de transfert en plastique de 3 ml à l’endroit où elle commence à se rétrécir. Cela sera utilisé pour transférer des tranches de cerveau. Pliez une aiguille de 27 G à la base d’environ 45° et fixez-la à une seringue de 1 ml. Celui-ci sera utilisé pour manipuler les tranches lors de la coupe.
2. Couper des tranches de cerveau
- Anesthésie une souris (P16-P18) avec de l’isoflurane à 2 % ou une méthode approuvée localement. Après l’induction, décapitez l’animal à l’aide d’une grande paire de ciseaux et déposez la tête dans la boîte de culture de 12 cm qui contient de la boue de solution de bouturage à bulles. Le lisier doit immerger totalement la tête pour un refroidissement rapide.
- Tenez l’avant de la tête d’une main, en épluchant la peau et le tissu conjonctif vers l’avant vers le nez. À l’aide des petits ciseaux, coupez le tissu conjonctif pour révéler le crâne sous-jacent. Retirez ensuite les muscles recouvrant la face dorsale du crâne et du cou.
- Retirez la cervelle du crâne en fixant d’abord l’avant du crâne à l’aide de la grande pince, puis faites deux entailles latérales à travers l’os de chaque côté du foramen magnum à l’aide des petits ciseaux (figure 1, entailles étiquetées A1 et A2).
- Faites une autre incision entre les yeux (juste en avant du bregma) (Figure 1, coupe étiquetée B), puis coupez soigneusement le long de la suture sagittale vers l’avant et réfléchissez les sections du crâne coupées pour révéler le cerveau (Figure 1, coupe étiquetée C).
- À l’aide de la petite spatule, prélevez le cerveau et placez-le sur un plat de culture. Soyez conscient des nerfs crâniens sur la face inférieure du cerveau qui devront être sectionnés, cela peut être fait à l’aide de la microspatule de plus petite taille. À l’aide de la spatule plus grande, transférez le cerveau dans le bécher de 25 ml rempli de boue de solution de coupe.
- Préparation de l’hémisphère cérébral pour le tranchage.
- Placez un morceau de papier filtre de 6 cm au fond d’un plat de culture frais, puis remplissez-le de boue de solution de coupe fraîche et de bulles. Utilisez la spatule la plus grande pour positionner le cerveau, côté ventral vers le bas, sur le papier filtre. Prenez une lame de rasoir à un tranchant neuve et nettoyée et coupez le cerveau pour enlever le cervelet, puis faites une coupe le long de la ligne médiane pour séparer le cerveau en deux hémisphères.
- Préparation du bloc de tissu vibratome.
- Prenez le bloc de tissu vibratome réfrigéré, séchez la surface et placez une goutte de colle cyanoacrylate au milieu, et étalez-la uniformément jusqu’à la taille approximative du cerveau. Utilisez la petite spatule pour manipuler l’un des hémisphères cérébraux sur la grande microspatule de sorte que le côté médial du cerveau soit vers le bas.
- Touchez le bord de la spatule à l’interface du cerveau sur le deuxième morceau de papier filtre pour retirer la plus grande partie possible de la solution. Faites glisser le cerveau de la spatule plus grande à l’aide de la plus petite spatule pour le guider sur la colle.
- Fixez le bloc de coupe dans la chambre du vibratome et remplissez la chambre de boue de solution de coupe et de bulles, en veillant à ce que le cerveau soit complètement immergé. Faites pivoter le bloc de coupe de manière à ce que la face ventrale du cerveau soit face à la lame.
- Trancher le cerveau.
note: Chaque vibratome est unique, alors suivez les instructions du fabricant.
- Réglez l’épaisseur de la tranche à 450 μm et assurez-vous que la lame vibre lorsqu’elle se déplace dans le cerveau à une vitesse d’environ 0,3 mm/s. Coupez entièrement à travers le cerveau de la face ventrale à la surface corticale, cela produira des tranches sagittales de cerveau entier qui peuvent être utilisées pour des enregistrements électrophysiologiques. Les tranches seront produites latéralement à médialement et généralement 3 à 4 tranches peuvent être coupées dans chaque hémisphère.
- Si la base de la tranche se soulève, utilisez l’aiguille pliée de 27 G pour appuyer doucement sur la tranche. Au fur et à mesure que chaque tranche est coupée, utilisez la pipette de transfert pour la déplacer sur la plate-forme de la chambre de maintien où elles sont viables jusqu’à 8 heures.
3. Enregistrements électrophysiologiques extracellulaires
- Montage de la tranche dans la chambre d’enregistrement.
- À l’aide de la pipette de transfert, placez une tranche de cerveau dans une chambre d’enregistrement immergée perfusée d’un écoulement de 1 à 2 ml/min et chauffée à 32 °C. L’aCSF utilisé pour les enregistrements diffère de celui utilisé dans la chambre de rétention, car la concentration de Mg2+ est augmentée de 2 mM à 4 mM.
- Fixez la tranche à l’aide d’une « harpe » (acier inoxydable semi-circulaire avec des brins de nylon étirés à 2 à 3 mm d’espacement). Placez la harpe de manière à ce que les brins soient parallèles à CA1. Augmentez la vitesse de perfusion à 8 - 10 ml/min à 32 °C.
- Sous un microscope à dissection, placez une électrode de stimulation et une électrode d’enregistrement (électrode de verre remplie de la solution d’enregistrement aCSF) à la surface de la couche radiale du CA1 (Figure 2A). Placez d’abord l’électrode de stimulation, puis placez l’électrode d’enregistrement.
- Stimulez les collatéraux de Schaffer avec une amplitude de 120 à 150 μA et une impulsion de test d’une durée de 0,1 ms, et observez la forme d’onde résultante du potentiel post-synaptique d’excitation de champ (fEPSP) pour déterminer l’état de la tranche (Figure 2B). Il peut être nécessaire de déplacer les électrodes de stimulation et d’enregistrement dans la tranche à environ 50 à 100 μm de la surface de la tranche pour obtenir un enregistrement fEPSP avec une petite volée de fibres et une grande amplitude. Les fEPSP collatéraux évoqués par Schaffer sont stéréotypés et fournissent un bon indicateur de la santé des tranches. Les tranches saines présentent généralement un rapport d’amplitude entre la volée de fibres et le fEPSP inférieur à 0,3.
- Repositionnement des électrodes.
- À l’aide d’un microscope à dissection, déplacer l’électrode de stimulation vers le milieu de la couche orienne et déplacer l’électrode d’enregistrement vers la couche cellulaire pyramidale aussi près que possible de l’électrode d’enregistrement, comme le montre la figure 3A. Il peut être nécessaire d’enfoncer les électrodes de stimulation et d’enregistrement dans la tranche d’environ 50 à 100 μm de sorte que l’amplitude de réponse fEPSP à l’impulsion de test de 120 à 150 μA soit d’environ 1 mV.
- Générer γ oscillations.
- Pour générer γ oscillations, stimulez le tissu avec un train de 20 impulsions de 0,1 ms délivrées à 200 Hz. Ce stimulus tétanique peut produire des réponses reproductibles lorsqu’il est administré toutes les 5 minutes.
- Utilisez les paramètres d’enregistrement suivants.
- Mettez à l’échelle le gain du signal de sortie pour qu’il corresponde à la plage de tension d’entrée du convertisseur analogique-numérique. Assurez-vous que l’excursion maximale du signal attendue utilise au moins 30 % de la plage de tension d’entrée. Soyez prudent lorsque vous réglez des gains trop élevés, car les signaux peuvent être écrêtés. La bande passante typique nécessaire pour les enregistrements sur le terrain est de 500 Hz avec un couplage AC à 0,1 Hz pour supprimer la dérive de la ligne de base.
- Numérisez au moins 4 à 5 fois plus vite que la fréquence d’angle du filtre passe-bas pour éviter le crénelage du signal.
