Enregistrement par électrorétinogramme à couplage direct de l’épithélium pigmentaire rétinien chez une souris

Résumé

Source : Miyagishima, K. J., et al. Électrorétinogramme à couplage direct (DC-ERG) pour l’enregistrement des réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo montre l’enregistrement d’un électrorétinogramme à couplage direct (DC-ERG) sur un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) de souris anesthésié et adapté à l’obscurité. Après avoir appliqué des gouttes dilatatrices, l’animal est placé dans une configuration d’enregistrement et l’électrode capillaire remplie d’un tampon de sel est placée sur la cornée. Après avoir établi la base de référence, le DC-ERG est enregistré.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Positionnement de la souris et de l’électrode

1. Gardez les souris toute la nuit dans une boîte bien ventilée et étanche à la lumière pour une adaptation à l’obscurité.
2. Les animaux ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (8 mg/kg).
3. Appliquez localement une goutte de HCl de proparacaïne à 0,5 % pour anesthésier la cornée, ainsi qu’une goutte de HCl de phényléphrine à 2,5 % et de tropicamide à 0,5 % pour dilater les pupilles.
4. Coupez les moustaches de la souris avec des ciseaux pour éviter que des contractions involontaires ne perturbent les électrodes capillaires en verre pendant l’enregistrement.
   note: Le protocole de stimulus de l’électrorétinogramme à couplage direct (DC-ERG) au sein du système ERG comporte plusieurs routines de stimulus intégrées qui peuvent être sélectionnées en cliquant sur l’étape (flèche vers l’avant) ou sur l’étape (flèche vers l’arrière). Seules les étapes 1, 4 et 5 du logiciel sont nécessaires pour préparer et effectuer l’enregistrement DC-ERG.
5. Dans le système ERG, le logiciel vérifie que le bon patient a été sélectionné. Cliquez sur le bouton vert Protocoles. Sous Description du protocole, sélectionnez DC-ERG. Cliquez ensuite sur Exécuter. Vérifiez qu’il s’agit du bon test en cliquant sur Oui.
6. Utilisez l’étape 1/6 pour allumer la lumière rouge à l’intérieur du dôme afin de positionner la souris et les électrodes tout en observant les changements d’impédance.
7. Placez la souris sur une table d’enregistrement chauffée et tentez soigneusement la peau de la patte arrière à l’aide d’une pince. Tenez fermement l’électrode de l’aiguille dans une main et insérez-la par voie sous-cutanée dans la patte arrière pour la fixer en place.
8. Placez l’électrode de référence Argent/Chlorure de siver (Ag/AgCl) (Table des matériaux) à l’intérieur de la bouche de sorte que la pastille frittée repose le long de la joue arrière et soit maintenue en place derrière les dents.
   note: Les électrodes à fil d’or ne doivent pas être utilisées comme électrode de référence buccale car elles ont des caractéristiques d’impédance différentes et augmentent le bruit crête à crête.
9. Avant de placer les électrodes capillaires dans l'œil de la souris, tenez le porte-électrode avec les capillaires en verre verticalement et effleurez le porte-électrode avec l'index pour éliminer les bulles qui ont pu être introduites. Remplissez l'embout avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) à l'aide d'une aiguille de 25 g attachée à une seringue et inspectez pour vous assurer qu'il n'y a pas de bulle d'air emprisonnée à l'extrémité. Positionnez le support d’électrode de manière à ce que l’extrémité ouverte des capillaires remplis de HBSS soit en contact doux avec la cornée.
10. Prenez des précautions particulières pour éviter d’introduire des bulles d’air en tenant le distributeur de gel lubrifiant pour les yeux à l’envers et en jetant les gouttes initiales. Placez une goutte de gel lubrifiant pour les yeux sur chaque œil pour maintenir la conductivité et éviter la dessiccation pendant l’enregistrement.

2. Enregistrement DC-ERG

1. Cliquez sur Étape (flèche vers l’avant) pour sélectionner l’Étape 4/6 « Flash long No-Li ».
2. Cliquez sur Impédance. Utilisez l’écran de vérification de l’impédance pour examiner les résistances des yeux gauche et droit. Les valeurs d’impédance pour les électrodes d’enregistrement à chaque œil devraient être similaires (~39 kΩ). Les valeurs d’impédance pour la masse et les électrodes de référence doivent être inférieures à 10 kΩ).
3. Cliquez sur Aperçu pour afficher les traces de l’œil gauche et de l’œil droit. Attendre qu’une base de référence stable soit atteinte (<10 min). Cliquez sur Arrêter pour quitter la trace preview.
   note: Les changements brusques de direction de dérive ou les bruits aberrants dans l’enregistrement ne s’amélioreront pas avec le temps et nécessiteront l’identification de l’électrode capillaire qui nécessite une attention particulière. La cause la plus probable est une bulle introduite à l’extrémité de l’électrode. Remplissez l’embout avec HBSS. Cliquez à nouveau sur Aperçu pour vérifier la référence.
4. Cliquez sur Étape (flèche vers l’avant) pour sélectionner Étape 5/6 « Long Flash 10 cd 7 min ». Cliquez sur Exécuter pour démarrer l’enregistrement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Électrode Ag/AgCl (bouche)	WPI Inc	EP1	Électrode de référence buccale pour souris
Tuile de céramique	Instrument Sutter	cts	Utilisé pour couper le tube capillaire en verre à une taille appropriée
Bâton de nettoyage à pointe de coton	Produits médicaux puritains	867-WC Sans colle	À utiliser comme entretoise pour améliorer l’ajustement de l’ensemble porte-électrode
Système d’électrorétinogramme (ERG)	Diagnosys LLC	Système E3	Système d’électrophysiologie visuelle pour diagnostiquer les affections ophtalmiques dans la recherche sur la vision et les essais de médicaments
bec Bunsen	Argos Technologies	BW20002460	Ou équivalent à façonner le verre sous la flamme
Tube capillaire en verre (1,5 mm)	Instruments Sutter	BF150-75	Pour le remplissage avec HBSS et le contact avec la cornée
Solution saline tamponnée de Hank (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	Référence 14175-095	Disponible dans le commerce. Maintenir chez RT
Filtre en ligne	Whatman	Référence 6722-5001	Pour protéger la pompe à vide des aérosols
Câble silencieux pour porte-microélectrodes	WPI Inc	Référence 5372	Suggéré pour améliorer la longueur et le placement des câbles et des ensembles de porte-électrodes
Rotule magnétique	WPI Inc	500871	Pour le positionnement magnétique de l’ensemble porte-électrode sur la platine
MatLab	Travaux mathématiques		MatLab : Pour l’édition du logiciel d’analyse
Boîte à outils Matlab Curvefit	Travaux mathématiques		Boîte à outils pour MatLab (uniquement nécessaire pour l’édition du logiciel d’analyse)
Compilateur MatLab	Travaux mathématiques		Boîte à outils pour MatLab (uniquement nécessaire pour l’édition et la réédition du logiciel d’analyse)
MatLab Runtime version 9.5	Travaux mathématiques	R2018b (9,5)	Requis pour faire fonctionner le logiciel d’analyse : https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Porte-microélectrodes (45 degrés)	WPI Inc	MEH345-15	Pour le maintien des capillaires
Aiguille (calibre 25)	Covidien	8881250313	Pour le remplissage des tubes capillaires avec HBSS
électrode à aiguille (terre)	Lien rythmique	13 mm - un elctrode	Électrode d’aiguille sous-cutanée (terre) pour souris (13 mm de long, aiguille de 0,4 mm de diamètre, fil de plomb de 1,5 m)
Régulateur/Conditionneur de puissance	Furman	P-1800	Ou équivalent pour supprimer le décalage CC du bruit introduit par la ligne électrique
Seringue (12 ml)	Monoject	1181200777	Pour le remplissage des tubes capillaires avec HBSS
Clip en T	Cole-Parmer	Référence 06852-20	Pour l’assemblage du porte-électrode
Dessiccateur sous vide	Bel-Art	Réf. 420120000	Fond et couvercle en polycarbonate transparent
Traitement pharmacologique
Gel lubrifiant pour les yeux	Alcon	Référence 0078-0429-47	Aide à lubrifier la surface de la cornée et à maintenir le contact électrique avec les électrodes capillaires
Chlorhydrate de phényléphrine 2,5 %	Akorn	Référence 17478-201-15	Gouttes ophtalmiques mydriatiques à courte durée d’action (pour la dilatation de la pupille)
Chlorhydrate de proparacaïne 0,5 %	Akorn	Référence 17478-263-12	Anesthésique local pour l’instillation ophtalmique
Tropicamide 0,5 %	Akorn	Référence 17478-101-12	Gouttes ophtalmiques mydriatiques à courte durée d’action (pour la dilatation de la pupille)
Xylazine	AnaSed	sc-362949Rx	Analgésique et relaxant musculaire
Zétamine (Kétamine HCl)	VetOne	501072	Anesthésique pour injections intramusculaires