Enregistrements électrophysiologiques de la drosophile sensille en réponse aux odorants volatils

Résumé

Source : Ng, R., et al. Enregistrement électrophysiologique de la sensille de Drosophila Trichoid en réponse à des odorants de faible volatilité. J. Vis. Exp. (2017).

Dans cette vidéo, une mouche drosophile vivante est montée dans un tube pour des études électrophysiologiques. Des électrodes sont positionnées à la base du sensillum pour enregistrer des réponses neuronales spécifiques aux phéromones avec les neurones récepteurs olfactifs de la mouche.

Protocole

1. Préparation du matériel pour l’enregistrement at4

1. À l’aide d’un instrument extracteur de pipette, préparer des électrodes avec des capillaires en verre d’aluminosilicate (D.E. 1,0 mm, D.E. 0,64 mm). Émoussez légèrement l’extrémité de l’électrode de référence à l’aide d’une paire de pinces fines pour faciliter l’insertion dans le clypeus de la mouche (c’est-à-dire une plaque arrondie à l’avant de la tête de la mouche, au-dessus des pièces buccales).
   REMARQUE : Des mâles WT (type sauvage) (Berlin) âgés de 7 jours ont été utilisés dans cette étude. Utilisez une solution saline AHL comme électrolyte pour les deux électrodes.
2. Préparez 1 L d'AHL (Adult Hemolymph-Like) en mélangeant 900 mL d'eau distillée avec 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO₃, 0,1120 g de NaH₂PO₄, 1,892 g de Tréhalose ּ2H₂O, 3,423 g de saccharose, 1,192 g d'HEPES(N-2-hydroxyethylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique), et 8,2 mL de 1M MgCl₂. À l’aide d’eau distillée, porter le volume total à 1 L. Porter le pH à 7,4 en utilisant 1 N de NaOH et stériliser la solution à l’aide d’un système de filtration sous vide. Pour un stockage à long terme, conserver les aliquotes AHL à 4 °C.
   REMARQUE : Des livraisons constantes d’acide palmitoléique dépendent de l’uniformité entre les cartouches. Chaque cartouche doit être assemblée de manière reproductible.
3. À l’aide d’une lame de rasoir, retirez 0,9 cm de l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 μL pour créer la première section de cartouche, mesurant 4,1 cm ; reportez-vous aux dimensions détaillées à la figure 1A. Utilisez une autre pointe de pipette de 200 μL et retirez 1,7 cm et 1,5 cm de la pointe et de la base pour créer la deuxième section de cartouche. mesurant 1,8 cm (Figure 1A). Utilisez une règle pour assurer la reproductibilité.
4. Utilisez une perforatrice de 1/8" pour découper des disques dans du papier filtre.
5. À l’aide d’une pince, placez un disque de papier filtre à l’extrémité de la deuxième section de cartouche. Confirmez visuellement une ouverture dans l’embout de la cartouche par laquelle l’air peut passer.
6. Fixez les première et deuxième sections de la cartouche, comme illustré à la Figure 1A. Inclinez la deuxième section de la cartouche vers le bas pour faciliter la visée carrée lors de la préparation (Figure 1B).
7. Connectez la cartouche avec le tube de diffusion d’odeurs monté sur un micromanipulateur.
   REMARQUE : cette conception permet de pivoter la cartouche vers l’extérieur pour faciliter le remplacement (Figure 1C).
8. Réglez le débit d’air humidifié constant à 2 L/min dans un régulateur de masse et le débit d’odorisant à 500 mL/min dans un autre régulateur de masse.
9. À l’aide du logiciel (voir le tableau des matériaux), programmez la procédure pour administrer une bouffée d’odeur de 500 ms.

2. Préparation des solutions odorisantes d’acide palmitoléique pour l’administration

REMARQUE : Les ORN Or47b réagissent à la fois à l’acide cis et à l’acide trans-palmitoléique. L’acide palmitoléique étant instable à RT, les stocks sont stockés à -20 °C et utilisés dans le mois suivant l’ouverture. L’éthanol est le solvant de choix pour l’acide palmitoléique.

1. À l’aide d’un mélangeur vortex, mélangez soigneusement 10 μL de stocks ou de dilutions d’acide cis- ou transpalmitoléique avec 90 μL d’éthanol à 100 % pour des dilutions en série de dix fois supérieures dans des microtubes de 1,7 mL. Préparez quotidiennement des dilutions d’acide palmitoléique frais avant les expériences et utilisez-les dans la journée.
   REMARQUE : Un flacon en verre est recommandé pour les odorisants non solubles dans l’éthanol afin de préparer des dilutions d’odeurs avec d’autres types de solvants organiques.
2. À l’aide d’une micropipette P10, appliquer 5 μL de solutions d’acide cis-palmitoléique des dilutions souhaitées sur le papier filtre dans chaque cartouche correspondante.
   REMARQUE : La dose la plus élevée (^10-1) contient 450 μg du composé. Pour les solutions d’acide trans-palmitoléique, appliquez plutôt 4,5 μL de sorte que la dose la plus élevée (^10-1 ) contienne 450 μg du composé.
3. Placez les cartouches d’acide palmitoléique dans un dessiccateur sous vide pendant 1 h à RT et 7,59 mmHg de pression pour évaporer complètement le solvant.
   REMARQUE : Les cartouches peuvent être utilisées jusqu’à 4 h à RT.

3. Préparation de la drosophile pour un accès facile à la sensille at4 pour les enregistrements électrophysiologiques in vivo

REMARQUE : Les mouches WT (Berlin) sont élevées dans un milieu standard de semoule de maïs à 25°C dans un cycle lumière-obscurité de 12:12. Lors de l’éclosion, les mouches sont séparées par sexe en groupes de dix, de sorte qu’elles sont logées en groupe jusqu’à l’âge de 7 jours. Les ORN (neurones récepteurs olfactifs) Or47b chez les mouches mâles et femelles répondent à l’acide palmitoléique. Par souci de simplicité, seules les mouches mâles sont examinées dans la présente étude.

1. Assemblez une lame de préparation à la mouche : sur une lame de verre, placez une lamelle en verre (18 x 18 mm2) sur une petite quantité de pâte à modeler, en formant un angle de ~3° avec la lame de verre. Placez du ruban adhésif double face sur le bord intérieur de la lamelle et sur la zone de la diapositive immédiatement en dessous. Remplacez-la par une bande neuve pour chaque jour d’enregistrement (Figure 2A).
2. À l’aide d’un aspirateur à mouches15, prélevez la mouche d’intérêt dans le tube, puis placez une pointe de pipette de 200 μL sur l’extrémité du tube. Simultanément, faites pivoter le tube vers l’avant tout en soufflant de l’air à l’intérieur pour pousser la mouche jusqu’à l’extrémité de la pointe de la pipette. Utilisez une lame de rasoir pour couper juste en dessous du corps de la mouche et à 2 longueurs de tête au-dessus de la mouche.
3. Tassez le bas de la pointe de la pipette avec de la pâte à modeler, en poussant la mouche vers le haut jusqu’à ce que les antennes et le clypeus soient exposés (figure 2B). Pour éviter de tuer la mouche, ajoutez juste assez d'argile pour exposer les antennes et les aristes, car cela empêche l'abdomen de la mouche d'être écrasé. De plus, ajoutez de l’argile lentement et doucement pour éviter toute constriction soudaine. Confirmez que la mouche est vivante en vérifiant le mouvement de l’antenne ou du proboscis.
4. Utilisez une pince pour manœuvrer la pointe de la pipette qui abrite la mouche. Orientez la tête de manière à ce que le clypeus soit tourné vers la droite de l'observateur. Ajustez la préparation le long de la lamelle à l’aide d’une pince fine jusqu’à ce que le côté latéral de l’antenne repose contre la surface de la lamelle collée (Figure 2B).
5. Placez une tige de maintien sur l’arista pour fixer l’antenne au ruban adhésif double face afin d’empêcher tout mouvement (Figure 2B).
   REMARQUE : La tige de maintien est tirée d’un capillaire en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de pipette et maintenue en position avec de la pâte à modeler (Figure 2A).
6. Placez la préparation sur la platine de l'appareil (Figure 2C). À l’aide du microscope, vérifiez que le trichoïde est visible le long du bord distal-latéral du troisième segment de l’antenne.
   REMARQUE : Les sensilles doivent se profiler sur l’arrière-plan, ce qui simplifie leur identification et facilite l’enregistrement (Figure 3). Dans cette préparation, les sensilles trichoïdes les plus accessibles sont de type at4.
7. Comme décrit précédemment, 2, 15, maintenir la préparation sous un flux d’air humidifié constant (2 L/min) délivré par un tube de distribution d’air séparé à environ 2 cm de la préparation (Figure 4).

4. Enregistrement de l’activité sensillum at4 des ORN Or47b dans les trichoïdes at4 en réponse à l’acide palmitoléique

1. Insérez l’électrode de référence dans le clypeus (Figure 3A). Avec un mouvement rapide et fluide, assurez-vous que l’électrode est insérée juste en dessous de la surface, où elle peut entrer en contact avec l’hémolymphe sous la cuticule pour éviter d’endommager les tissus.
2. Abaissez lentement l’électrode d’enregistrement jusqu’à ce qu’elle entre dans le même plan de vue que le sensillum cible (Figure 3B). Enregistrez sous un objectif 50X.
   note: La cuticule trichoïdale dure nécessite l’insertion de l’électrode d’enregistrement dans la base sensillaire, dont la zone plus large fournit une cible plus grande qui réduit la probabilité que l’électrode soit déviée (Figure 3B, en médaillon).
3. Avant d’appliquer des stimuli olfactifs à un sensillum, observez les critères de sélection suivants : tout trichoïde ne répondant pas à ces normes doit être rejeté, et un autre sensillum doit être choisi à la place.
   1. Observez un rapport signal/bruit élevé (voir la figure 3C pour un exemple).
   2. Observez des pics identifiables à partir des neurones at4A et at4C (Figure 3C).
      REMARQUE : L’amplitude du pic at4B semble très similaire à celle d’at4A10 et ne peut pas être facilement identifiée sans stimulation olfactive.
   3. Observez que le taux de décharge basale des neurones at4A est autour ou en dessous de 20 Hz.
      REMARQUE : Ce critère est spécifique pour at4A car le taux de décharge basale du neurone est supérieur à celui des ORN basiconiques. Une décharge basale beaucoup plus élevée indique que les neurones ont peut-être été endommagés lors de l’insertion de l’électrode.
4. Connectez la cartouche au tube de distribution d’odorisant. Commencez par le contrôle des solvants puis des odorisants, des concentrations faibles aux concentrations élevées. Utilisez le micromanipulateur pour manœuvrer la cartouche vers la préparation tout en visant la cartouche carrément vers la tête de la préparation. Vérifiez visuellement que la cartouche est pointée directement sur l’antenne (Figure 4) à quelques millimètres de distance.
   REMARQUE : Le but est d’orienter l’ouverture de la cartouche directement sur l’antenne et de la positionner près du tissu cible.
5. Assurez-vous que la cartouche d’odorisant est séparée de l’électrode d’enregistrement à sa droite de 1 à 2 mm et de la lame de préparation des mouches en dessous d’environ 1 mm.
   note: Dans la configuration décrite ici, la cartouche d’odorisant est étroitement bordée par l’électrode d’enregistrement, l’électrode de référence et la lame de préparation à la mouche (Figure 4).
   REMARQUE : Tenez compte de la distance entre la cartouche et les électrodes d’enregistrement/de référence. Une distance d’environ 4 mm est recommandée. Un contact involontaire peut interrompre le signal et casser l’extrémité de l’électrode d’enregistrement, endommageant le neurone actuel et compliquant les enregistrements ultérieurs.
   REMARQUE : Tenez compte de la distance séparant la cartouche et la glissière de préparation à la mouche. Le fait de toucher la lamelle peut également déloger l’électrode d’enregistrement, perturbant ainsi l’enregistrement.
6. Appuyez sur « Enregistrer » dans le logiciel d’acquisition de données pour commencer l’enregistrement.
   REMARQUE : Pour chaque enregistrement de 10 s, une seule impulsion d’odeur de 500 ms est délivrée directement à l’antenne, comme décrit à l’étape 1.9.
7. Une fois l’odorisant appliqué, rétractez soigneusement la cartouche avant de la remplacer par une cartouche de la concentration la plus élevée. Continuer jusqu’à l’obtention de toute la plage posologique.
   REMARQUE : Il est recommandé d’enregistrer un seul ORN Or47b pour chaque mouche afin d’éviter tout effet d’adaptation possible.
8. Rincez abondamment l’électrode d’enregistrement à l’eau distillée après avoir terminé l’enregistrement de la journée.
9. Analysez et tracez les données à l’aide d’un logiciel d’analyse hors ligne disponible dans le commerce.

Résultats

Figure 1 : configuration de la cartouche et de l’olfactomètre. (A) Préparation des cartouches anti-odeurs. De gauche à droite : une pointe de pipette standard de 200 μL, les première et deuxième sections de la cartouche et une cartouche d’odorisant terminée. (B) La cartouche reliée à l’olfactomètre, montrant l’inclinaison vers le bas de la deuxième section. (C) Configuration de l’olfactomètre représentant le t...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Configuration de préparation et matériaux divers
Instrument extracteur de pipette	Sutter Instruments, Novato, Californie, États-Unis	P97	Extracteur de pipette
Capillaires en verre borosilicaté	World Precision Instruments, Sarasota, Floride, États-Unis	1B100F-4	pour fabriquer des tiges de maintien
Capillaires en verre d’aluminosilicate	Sutter Instruments, Novato, CA, États-Unis	AF100-64-10	pour fabriquer des électrodes
Lames de microscope Superfrost	Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis	Tél. : 12-550-143	pour station de préparation de mouches
Ruban adhésif double face permanent	Scotch St. Paul, Minnesota, États-Unis	Na	pour station de préparation de mouches
Microscope droit	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japon	BX51	pour plate-forme d’enregistrement
Pâte à modeler Plastalina	Van Aken, North Charleston, Caroline du Sud, États-Unis	B0019QZMQQ	pour la station de préparation et pour stabiliser la tige de maintien
Unité de filtration stérile jetable à débit rapide avec membrane SFCA, 0,45 mm	Nalgene, Rochester, NY, États-Unis	#156-4045	pour stériliser la solution AHL
Pointe de pipette de 200 μL	VWR Radnor, Pennsylvanie, États-Unis	Référence 53508-810	pour fabriquer des cartouches anti-odeurs et la préparation des mouches
Papier filtre	Whatman, Maidstone Kent Royaume-Uni	740-E	Pour fabriquer des cartouches anti-odeurs
Dessiccateur sous vide	Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, États-Unis	VX-06514-30	pour vaporiser du solvant à l’éthanol
Acide cis-palmitoléique	Cayman Chemical, Ann Arbor MI États-Unis	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Or47b odorisant
Acide trans-palmitoléique	Cayman Chemical, Ann Arbor MI États-Unis	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Or47b odorisant
éthanol	Spectrum Chemical MFG. Nouveau-Brunswick, NJ, États-Unis	E1028-500MLGL	pour diluer l’acide palmitoléique
Micromanipulateur à cartouche d’odorisant	Siskiyou, Grants Pass OU États-Unis	MX130R	Pour positionner l’olfactomètre
Logiciel Flow Vision	Alicat, Tuscon AZ États-Unis	FLOWVISIONSC	logiciel de contrôle du débit
Régulateur de masse	Alicat, Tuscon AZ États-Unis	MC-2SLPM-D	pour contrôler le débit de l’air humidifié
Régulateur de masse	Alicat, Tuscon AZ États-Unis	MC-500SCCM-D	pour contrôler le débit pour la stimulation des odeurs
Clampex	Molecular Devices, Sunnyvale, Californie, États-Unis	Ver. 10.4	Logiciel d’acquisition de données
Tube de distribution d’air	Ace Glass, Vineland, NJ, États-Unis	Référence 8802-936	pour fournir de l’air humidifié
Objectif 50X	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japon	LMPLFL50X	Plate-forme d’enregistrement
Clampfit 10	Molecular Devices, Sunnyvale, Californie, États-Unis	Ver. 10.4	Logiciel d’analyse des pointes
Igor Pro 6	WaveMetrics, lac Oswego OU États-Unis	Ver. 6.37	Logiciel d’analyse de données
Moniteur audio	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, États-Unis	NPIEXB-AUDIS-08B	Rapports auditifs sur les pics individuels
Amplificateur extracellulaire	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, États-Unis	NPIEXT-02F	pour augmenter l’amplitude des signaux électriques
Contrôleur de soupape	Warner Instruments	VC-8	pour contrôler l’ouverture de la valve pour la stimulation des odeurs
Micromanipulateur d’électrodes d’enregistrement	Sutter Instruments, Novato, CA, États-Unis	Réf. MP-285	pour positionner l’électrode d’enregistrement
Amplificateur Headstage	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, États-Unis	EQ-16.0008	pour augmenter l’amplitude des signaux électriques
oscilloscope	Tektronix, Beaverton OU États-Unis	TDS2000C	Rapport visuel des pics individuels