Stimulation des racines nerveuses auditives et enregistrements de courant postsynaptique dans une tranche de coin cérébral de souris

Résumé

Source : Fischl, M. J., et al. Préparation de tranches en coin in vitro pour imiter la connectivité des circuits neuronaux in vivo. J. Vis. Exp.(2020)

Cette vidéo présente un protocole pour stimuler la racine nerveuse auditive et enregistrer les courants postsynaptiques dans les neurones olivocochléaires médians dans des tranches de coin cérébral de souris.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Configuration et enregistrement de l’électrophysiologie

1. Placez la tranche de coin dans la chambre d’enregistrement et fixez-la avec une harpe ou un système de stabilisation. Perfuser le tissu en continu à un débit de 7 à 10 mL/min avec de l’ACSF chaud (35 °C) bouillonné de carbogène.
2. Identifiez les neurones MOC olivocochléaires médians génétiquement marqués dans le noyau ventral du corps trapézoïdal VNTB à l’aide de l’épifluorescence avec des filtres d’émission de 561 nm pour les enregistrements patch-clamp. Retournez la tranche s’il n’y a pas de cellules potentiellement corrigibles.
3. À l’aide de l’optique DIC, concentrez-vous sur la racine nerveuse auditive sur le côté épais de la tranche et utilisez un micromanipulateur pour déplacer l’électrode bipolaire de stimulation du tungstène jusqu’à la racine nerveuse auditive et doucement dans la surface du tissu.
   note: Les électrodes d’aspiration ont été utilisées dans des expériences de stimulation des nerfs auditifs dans d’autres laboratoires. Des électrodes en verre thêta ou des méthodes de stimulation optique peuvent être utilisées si elles s’appliquent à d’autres préparations spécifiques.
4. Replacez le champ de vision sur le VNTB pour choisir un neurone MOC à cibler pour l’électrophysiologie du patch clamp.
5. Remplissez une pipette d’enregistrement avec une solution interne appropriée pour l’expérience proposée.
6. Appliquez un patch et enregistrez à partir du neurone MOC dans la configuration de la cellule entière. Compensez la capacité de la membrane et la résistance en série si nécessaire.
7. Ajustez l’amplitude de stimulation électrique de la racine nerveuse auditive pour obtenir des événements postsynaptiques cohérents dans le neurone MOC.
   note: Il peut être nécessaire de déplacer l’électrode de stimulation.
8. Exécutez des protocoles de stimulation appropriés pour observer les courants synaptiques évoqués en MOC (pince de tension).
   note: La préparation de la tranche de coin peut être utilisée avec n’importe quel outil de patch-clamp typique tel que les enregistrements de patchs en vrac, la pharmacologie, l’optogénétique, l’imagerie calcique, le décageage de neurotransmetteurs, etc.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope confocal droit A1R	Instruments Nikon		Microscope d’électrophysiologie et d’imagerie, peut être n’importe quel microscope compatible avec l’électrophysiologie
Électrode en verre borosilicaté avec filament OD 1,5 mm, ID 1,1 mm, 10 cm de long	Instrument Sutter	Réf. BF150-110-10	Patch de serrage de pipette en verre
Remplisseuse d’électrodes MicroFil	WPI	CMF20G	Remplisseuse de pipette à électrode patch
Réchauffeur de solution en ligne	Warner Instruments (GSAdvantage)	SH-27B	Système de perfusion de tranches chauffant
Systèmes multi-micromanipulateurs	Instruments Sutter	MPC-200 avec MP285	Micromanipulateurs pour le placement du patch clamp et de l’électrode de stimulation
P-1000 Extracteur de pipette horizontal pour micropipettes en verre	Instruments de sutter	FG-P1000	Extracteur de pipette Patch Clamp
Amplificateur patch-clamp et logiciel	HEKA	EPC-10 / Patchmaster Suivant	Peut être n’importe quel amplificateur/logiciel
Chambre d’enregistrement	Warner Instruments	RC26G	Tranche « bain » pendant l’enregistrement
Harpe de chambre d’enregistrement	Warner Instruments	640253	Stabilise la tranche pendant l’enregistrement électrophysiologique
Chambre d’incubation de tranches	Construction sur mesure		Chambre de maintien chauffée et oxygénée pour les tranches lors de la récupération après le tranchage
Unité d’isolation de stimulus	A.M.P.I.	Iso-Flex	Unité d’isolement de stimulus pour l’électrophysiologie
Seringue 60CC	Fischer Scientific (centres commerciaux)	Référence : 14-820-11	Électrophysiologie manipulation des fluides de perfusion
Régulateur de température	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	Régulateur de température du système de perfusion de tranches
Tube 1/8 OD 1/16 ID	Fischer Scientific (centres commerciaux)	Tél. : 14-171-129	Électrophysiologie manipulation des fluides de perfusion
Microélectrode bipolaire concentrique de Tugsten	WPI	TM33CCINS	Électrode stimulante pour l’électrophysiologie