Enregistrement des réponses synaptiques CA3-CA1 dans une tranche d’hippocampe de rat

Résumé

Source : Shetty, M. S. et al., Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents.J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo montre une méthode pour enregistrer les réponses synaptiques CA3-CA1 dans une tranche d’hippocampe de rat. Il décrit les étapes à suivre pour placer les électrodes de stimulation et d’enregistrement sur la tranche d’hippocampe et pour mesurer le potentiel postsynaptique excitateur de champ (fEPSP) afin d’évaluer la force de la réponse synaptique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Enregistrement des réponses synaptiques CA3-CA1

REMARQUE : La configuration électrophysiologique utilisée pour l’enregistrement du potentiel de champ est illustrée à la figure 1A. Une cage de Faraday est fortement recommandée si les interférences électriques sont hors de contrôle après la mise à la terre correcte des paramètres électriques. De nombreux types de chambres immergées et d’interface sont disponibles dans le commerce. Cependant, les chambres d’interface sont préférées car les coupes y présentent des réponses synaptiques plus robustes.

1. Positionnement des électrodes
   1. Allumez l’appareil électrique (stimulateurs et amplificateurs) à utiliser. Montez et fixez les électrodes de stimulation et d’enregistrement dans les supports en plexiglas des micromanipulateurs.
      note: Nous utilisons des électrodes monopolaires, laquées, en acier inoxydable d’une résistance de 5 MΩ à des fins de stimulation et d’enregistrement.
   2. Avant utilisation, insérez ces électrodes à l’intérieur des capillaires en verre tiré et fixez-les avec de la colle époxy, en n’exposant qu’une petite partie de l’embout de l’électrode (Figure 1E). Cela donne de la force aux électrodes autrement minces et aide à les fixer fermement dans les porte-électrodes.
   3. Guidés au microscope, positionnez la ou les électrodes de stimulation dans la couche radiale de la région CA1 pour stimuler les fibres collatérales de Schaffer et l’électrode enregistreuse dans la région dendritique apicale de CA1 pour enregistrer les réponses EPSP de champ (fEPSP).
      note: S’approcher de la surface liquide au-dessus de la tranche avec les électrodes donne un son qui aide à localiser rapidement la surface de la tranche (à condition que l’amplificateur soit connecté à un haut-parleur).
   4. Dans les expériences de marquage et de capture synaptiques, selon les besoins de l’expérience, positionnez deux ou trois électrodes de stimulation (S1, S2 ou S3) de chaque côté de l’électrode d’enregistrement pour stimuler deux ou plusieurs entrées indépendantes mais qui se chevauchent. Placez les électrodes de stimulation et d’enregistrement à environ 200 μm l’une de l’autre.
   5. Si nécessaire, placer une autre électrode d’enregistrement dans la couche pyramidale pour enregistrer le pic de population (figure 2A). Lorsque les deux électrodes ont touché la tranche, à l’aide du logiciel d’acquisition, effectuez un test de stimulation pour assurer un signal fEPSP correct.
      note: Nous utilisons des impulsions biphasiques à courant constant (durée d’impulsion 0,1 ms/demi-onde) pour la stimulation des tests.
   6. Une fois qu’un signal fEPSP correct est obtenu, abaissez soigneusement les électrodes à environ 200 μm de profondeur à l’aide des boutons de mouvement fins des manipulateurs. Attendez 20 min pour que les tranches récupèrent.
2. Relation entrée-sortie
   1. Déterminez la relation entrée-sortie (stimulation afférente vs pente fEPSP) pour chaque entrée en mesurant la valeur de la pente à une gamme d’intensités de courant. Effectuez cette opération entre 20 μA et 100 μA. Réglez ensuite l’intensité de stimulation pour chaque entrée afin d’obtenir 40 % de la pente maximale du fEPSP. Maintenez cette constante tout au long de l’expérience.
   2. Après 15-20 min, commencez à enregistrer la ligne de fond. Surveillez de près la pente du fEPSP pendant cette période et réinitialisez l’intensité du stimulus si la pente fluctue de plus de 10 % par rapport à la valeur définie et commencez une nouvelle ligne de base. Enregistrez au moins 30 minutes ou 1 heure de référence stable avant de continuer.
      note: Pour le test ou la stimulation de base, nous utilisons quatre balayages d’impulsions biphasiques à courant constant de 0,2 Hz (0,1 ms par polarité) données toutes les 5 min. Une pente moyenne de ces quatre réponses est alors considérée comme une répétition. Les signaux sont filtrés et amplifiés par un amplificateur différentiel, numérisés à l’aide d’un convertisseur analogique-numérique et surveillés en ligne avec un logiciel sur mesure.

Résultats

Graphique 1.Dispositif électrophysiologique pour les enregistrements de potentiel de champ, composé (A) de stimulateurs, (b) d’un amplificateur différentiel, (c) d’un convertisseur analogique-numérique, (d) d’un oscilloscope, (e) d’un ordinateur avec logiciel d’acquisition, (f) d’un microscope de table résistant aux vibrations (g) d’un microscope à grossissement >4x), d’une...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
I. Produits chimiques composants de l’ACSF
1. Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
2. Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
3. Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H20)	Sigma-Aldrich	M1880
4. Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2.2H2O)	Sigma-Aldrich	Réf. C3881
5. Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	Réf. P9791
6. Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
7. D-Glucose anhydre (C6H12O6)	Sigma-Aldrich	Réf. G7021
II. Instruments d’électrophysiologie
1. Microscope	Olympus, Japon	Modèle SZ61
2. Régulateur de température	Conception de systèmes scientifiques inc. Canada	PTC03
3. Amplificateur différentiel à courant alternatif	AM Systems, États-Unis	Modèle 1700
4. Stimulateur d’impulsions isolé	AM Systems, États-Unis	Modèle 2100
5. Oscilloscope	Rhode & Schwarz	HM0722
6. Convertisseur numérique-analogique	Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, Royaume-Uni	CED-Power 1401-3
7. Chambre de tranche de cerveau d’interface	Conception de systèmes scientifiques inc. Canada	BSC01
8. Pompe à tube	Ismatec, Idex Health & Science, Allemagne	REGLO-Analogique
9. Débitmètre à carbogen	Cole-Parmer	Référence 03220-44
10. Illuminateur de lumière à fibre	Dolan-Jenner Industries	Fibre Lite MI-150
11. Micromanipulateurs	Marzhauser Wetzlar, Allemagne	00-42-101-0000 (MM-33)
		00-42-102-0000 (MM-32)
12. Électrodes	AM Systems, États-Unis	571000 (Acier inoxydable ; 0,010, 5 MΩ, 8 degrés)